Interrelationship between autophagy and ER stress, and their impact on the fate of prostate cancer cells treated with therapeutic drugs

Et problem ved kreftterapi er kreftcellers motstandsdyktighet mot behandling som er ment å drepe kreftcellene eller hemme deres vekst. Det er derfor viktig å forstå hvordan terapeutiske stoffer påvirker cellulære stressresponser som har innflytelse på kreftcellenes overlevelse og vekst, samt sammenhengen mellom disse. Endoplasmatisk retikulum stress (ER stress) og autofagi (lysosomal degradering av intracellulært materiale) er to cellulære stressresponser som ofte ser ut til å være påvirket av kreftterapi, og som trolig spiller en viktig rolle i å avgjøre skjebnen til kjemoterapi-behandlede kreftceller. I dette prosjektet har vi undersøkt hvordan ulike terapeutisk relevante forbindelser påvirker ER stress og autofag aktivitet i prostatakreftceller og andre kreftcelletyper, hvordan ER stress-responser påvirker autofag aktivitet, og hvordan ER stress og autofagi påvirker kreftcellers overlevelse og vekst. Oppsummering av resultatene: 1) Viktig forarbeide og metodiske forbedringer: Til vår overraskelse, og i motsetning til hva man har trodd de siste 10-15 år, fant vi at den autofage markøren LC3 ikke er nødvendig for generell autofagi i mammalske celler, og transport av LC3 til cellens degraderingsmaskineri (lysosomene) samsvarte dårlig med autofag aktvitet (Exp Cell Res 333, 21-38, 2015; FEBS J 282, 2202-14, 2015; Autophagy 12, 439-41, 2016). Dette er et svært viktig funn fordi kunnskapen om de biologiske og fysiologiske rollene til autofagi generelt, og om sammenhengen mellom ER stress og autofagi i kreftceller, i stor grad er basert på bruk av LC3 som markør for autofagi, i stedet for på direkte målinger av autofag aktivitet. Som en konsekvens ble det vesentlig for oss å benytte LC3-uavhengige metoder for å måle autofagi, noe som var lite utviklet. Vi lyktes i å forenkle, forbedre og validere to opprinnelig tungvinte biokjemiske metoder for tids- og kostnads-effektiv måling av autofag aktivitet (Methods 75, 25-36, 2015; Autophagy 12, 1-222, 2016; Methods Enzymol 587, 351-364, 2017; JoVE, 127, 2018; Bio-Protoc, 8, 2018). 2) Med disse forbedrede metodene foretok vi så en detaljert studie av hvordan autofagi og celledød i kreftceller påvirkes av de ER stress-induserende stoffene tunicamycin (glykosyleringshemmer) og thapsigargin (ER kalsiumpumpehemmer), samt terapeutisk relevante analoger av sistnevnte, hvorav to er under klinisk utprøvning. - Thapsigargin og de klinisk relevante thapsigargin-analogene blokkerte autofagi i prostatakrefteceller og andre kreftceller. I tillegg induserte de en langvarig ER stress-respons, som førte til celledød. Disse effektene skyldtes sterk tømming av kalsium fra ER, men ikke forandringer i cytosoliske kalsiumnivåer. Ved lavere konsentrasjoner induserte forbindelsene en mildere, delvis tømming av ER kalsium. Dette ga ingen ER stress eller celledød, og påvirket ikke autofagi, men hadde en klar veksthemmende effekt på kreftcellene. Dette har generell interesse, siden ER stress og endringer i ER kalsiumnivåer ofte er forbundet. Samtidig viser det at ulik dosering av de klinisk relevante thapsigargin-analogene vil kunne gi ulike cellulære effekter, som alle vil bidra til å stoppe kreftcellenes vekst. Resultatene er publisert i to artikler (J Biol Chem 292, 19656-73, 2017; Cell Calcium 76, 48-61, 2018). - Vi har undersøkt i mer detalj hvordan thapsigargin og analogene induserer celledød. Vi fant at forbindelsene induserer en programmert celledød via transkripsjonell oppregulering av pro-apoptotiske genprodukter. Videre har vi avdekket hvilke deler av ER stress-signaleringen som formidler dødssignalene, samt rollen av autofagi og autofagi-relaterte genprodukter. Funnene er under bearbeidelse for publisering. - I motsetning til thapsigargin og thapsigargin-analogene fant vi at tunicamycin aktiverte autofagi i prostatakreftceller, og det på en måte som var totalt avhengig av ER stress-signalering. Tunicamycin reduserte ikke ER kalsiumnivåer, noe som viser at ER stress ikke alltid er forbundet med endringer i kalsiumhomeostase. To komponenter av ER stress-signaleringen var essensielle for ER stress-indusert autofagi. Disse påvirket to ulike trinn i den autofage prosessen via hhv transkripsjonelle effekter (forandringer i genuttrykk) og signallering. Funnene er under bearbeidelse for publisering. Tunicamycin kunne indusere autofagi i like sterk grad i ikke-tumorigene celler som i kreftceller. Imidlertid aktiverte ikke tunicamycin autofagi i alle celletyper, på tross av universell induksjon av ER stress-signalering. Lagt sammen har prosjektet gitt oss ny forståelse av hvordan de ulike delene av ER stress-signaleringen regulerer autofagi og celledød i kreftceller utsatt for terapirelevant stress. Samtidig indikerer resultatene at effekten av ER stress på autofagi, celledød, og vekst er svært kontekstavhengig. Å forstå hvorfor, og hvilke faktorer som bestemmer utfallet under ulike betingelser blir viktig for å definere nye effektive kombinasjoner av kjemoterapi.

The ability of cancers to resist various types of therapeutic drugs is a major obstacle to effective treatment. Recent studies have implicated endoplasmic reticulum (ER) stress pathways and the lysosomal-degradative pathway of autophagy in mediating respo nses to therapeutic stress. However, this is based on circumstantial evidence since assays to measure autophagic activity have not been used. In the current proposal we will for the first time introduce assays of autophagic sequestration and degradation, which we have recently established in prostate cancer cell lines, in a focused screen of therapeutically relevant drugs for prostate cancer. We will compare prostate cancer cells versus normal prostatic epithelial cells for their ability to activate autop hagy and ER stress pathways in order to assess whether cancer cells may be primed to respond with these pathways upon therapeutic insults. Next, we will use siRNA silencing as well as novel and potent inhibitors of the ER stress pathway to determine the r elationship between ER stress and autophagy in the context of drug-induced stress, and conversely we will measure the effect on ER stress pathways upon selective inhibition of autophagy. Finally, we will determine the effect of alterations in ER stress an d autophagy pathways on cell proliferation and cell death, with the goal of deciphering their impact on cell fate, as well as to define novel drug combinations that can inhibit growth and induce cell death in prostate cancer cells.