Structural basis for electron transfer in and between redox proteins - recognition, selectivity and flexibility.

Proteiner er essensielle bestanddeler av alle typer organismer. De har utallige funksjoner som går fra å katalysere biokjemiske reaksjoner, sende og motta signaler til å bygge opp strukturelle strukturer. En type av slike proteiner er redoksproteinene, og noen av disse er involvert i elektrontransport. Alle organismer er avhengig av elektrontransport i sentrale prosesser som fra oksidering av substrat til celleånding og fotosyntese. Sentralt for dette er dannelsen av komplekser mellom forskjellige proteiner under elektronoverføringene. Elektronoverføringene utføres hovedsakelig av proteiner som inneholder såkalte redokskofaktorer. I stor grad har det strukturelle grunnlaget for spesifisiteten mellom disse redoksproteinene manglet. Prosjektet har fokuserert på å forstå disse aspektene, og å forstå hvordan disse proteinene gjenkjenner og interagerer med hverandre, og hvordan disse redoksnettverkene har kunnet aktivere forskjellige enzymsystemer. Vi har kartlagt disse interaksjonene i et flavinnettverk i en organisme som heter Bacillus cereus ved å undersøke disse proteinene med forskjellige biokjemiske og biofysikalske metoder. Dette har gitt ny innsikt med henblikk på selektiviteten, spesifisiteten og fleksibiliteten til disse til disse proteinene. Den sekvensielle elektronføringen i nettverket vi har studert foregår fra NADPH til flavodoksinreduktaser til flavodoksiner og tilslutt til redoksenzymet. I Bacillus cereus har vi uttrykt, renset og krystallisert alle de tre flavodoksinreduktasene, og løst strukturen til to av dem. For et av nettverksveiene har kinetikk og bindingstudier vist at flavodoksin reduktasene kan aktivere ribonuleotidreduktase systemet, og at en av reduktasene er den foretrukne redokspartneren. Vi har videre studert resten av dette flavinredoksnettverket med totalt seks proteiner og 3x3 kombinasjoner av redokspartnere, og vist med kinetikk at for dette nettverket i Bacillus cereus, så er det et sett av redokspartnere som har mye høyere aktivitet enn de andre kombinasjonene. Vi har vist at en rettesnor for denne diskrimineringen ligger i redokspotensialene som vi også har bestemt for alle partnerne. Vi har dessuten identifisert en ny underklasse av såkalte tioredoksinlike flavodoksinreduktaser. Videre har vi løst strukturen til en av flavodoksinene involvert her. Det har gitt ny innsikt i hydrogenbindingsnettverket rundt flavingruppen som er viktig for å forstå tuningen av rekoksaktiviteteten til proteinet. På grunn av den veldig høye subatomære oppløsningen på disse strukturene har vi klart å skille ut at deler av flavingruppen i disse strukturene er uordnet med en hoved og en delkonformasjon. Strukturen til den flavodoksinhomologe tioredoksinreduktasen i system er blitt strukturbestemt. Dette har vist at kun et av NADPH setene er naturlig okkupert, som gir mulig grunnlag for negativ kooperativitet. Dette krever ytterligere undersøkelser. For det andre enzymsystemet vi har sett på, nitrogenoksidsyntase, har vi ut fra bindingsstudier fått ny innsikt i hem-miljøet i den neuronale varianten, og identifisert en ny diflavinreduktase for den bakterielle varianten. Resultatene som har blitt beskrevet ovenfor har blitt presentert på mange nasjonale og internasjonale konferanser som de europeiske krystallografimøtene, de internasjonale konferansene i biouorganisk kjemi, det internasjonale flavin møtet, Gordon konferanse om enzymer o.l. både gjennom postere og foredrag. Resultatene beskrevet over har resultert i flere publiserte artikler i tidskriftene Biochemistry (2x), Protein Science, Bio-Protocols, Febs Open Bio og Acta Crystallographica. De siste resultatene blant annet på nitrogenoksidsyntase, høyoppløste flavodoksinstrukturer og tioredoksinreduktase skrives nå sammen, og vil bli publisert gjennom flere forskjellige artikler. I tillegg har vi publisert en artikkel i tidsskriftet Biochemistry and Molecular Biology Education om et 2,5 uker intensivkurs, som er basert på vår forskning om en av de flavodoksinlignende proteinene som er en del av redoksnettverket som studeres i dette prosjektet. Det er viktig å øke forskningsrelevansen også i generelle bachelor- og masterkurs, som er det dette kurset prøver på. Forskningsresultatene fra dette prosjektet er tilgjengelig for både nasjonale og internasjonale forskere, og vil kunne danne grunnlaget for nye studier innen dette feltet. Prosjektet har vært gjennomført med fokus på de sentrale målsetningene om å øke forståelsen av noen redoksnettverk i en modellorganisme, som har gått på å både å karakterisere de enkelte proteinene og forstå samhandlingen mellom dem. Det har derfor vært en balansegang mellom sikre delprosjekter, og mer utfordrende delprosjekter. Forskningen i prosjektet er grunnforskning, men denne fundamentale forståelsen av enzymaktivering og elektronoverføring kan ha relevans både mot medisinsk forskning mot hemming av enzymer, og mot industri som ønsker å optimalisere enzymer for industriell produksjon.

Prosjektet har hatt fokus på å forstå hvordan biologiske systemer som involverer aktivering av redoksenzymer fungerer på et molekylært og atomært nivå ved å bruke en kombinasjon av forskjellige biokjemiske og biofysikalske metoder. Gjennom prosjektet har man fått økt forståelse av enzymaktiveringsnettverket for en gruppe redoksproteiner i bakterier, og vist at de enzymsystemene som har blitt studert har mer dedikerte aktiveringspartnere selv når det er flere muligheter. Videre har det vist at drivkraften i større grad er bestemt av elektronoverføringen enn bindingsinteraksjonen. Dette er kunnskap som kan brukes med tanke på både medisinsk og industriell anvendelse. Prosjektet har hatt internasjonalt samarbeid i skjæringspunktet mellom kjemi, biologi og fysikk samt benyttet avanserte internasjonale forskningsanlegg. Dette har fungert som en kompetanse og nettverksbygging for personene involvert i prosjektet.

Redox proteins acting in electron transfer are essential for life. All organisms rely on electron transport to facilitate molecular transformations and for fundamental processes ranging from substrate oxidation to respiration and photosynthesis. Key to th ese roles is the formation of transient inter-protein electron transfer complexes. The electron transfers are predominantly performed by proteins containing redox active cofactor as hemes, iron-sulfur clusters, flavins, disulfides, quinonens or NADPH. The structural basis for the control of specificity between these redox partner proteins is largely lacking. We will address these issues, and understand how these proteins recognise and associate with each other, and how specific, selective and flexible the se protein-protein interactions are. We have recently solved the structure of several of these proteins in Bacillus cereus, and also the protein-complex between a flavodoxin-like protein and a di-metal protein. We intend to try to map these interactions b y combining co-crystallisation of all the different complexes, and standard biochemical and biophysical methods to determine binding constants, redox potentials and kinetics, supplemented by spectroscopic studies (UV-vis, Raman and EPR spectroscopy). Some of these interactions are more unspecific, while others are very specific. The crystallisation of all of the protein-protein complexes will be challenging especially for those with very unspecific interactions. By mapping larger networks of redox protein s and enzyme systems, we hope to reveal more of the structural basis governing these interactions, which would be a clear step forward in understanding of electron transfer in proteins. This insight will further be linked to understanding the mechanism of the partner enzymes.