Use of gnotobiotic cod larvae (Gadus morhua L.) to unravel host-microbe interactions

Bruk av gnotobiotiske torskelarver for å avdekke vert-mikrobeinteraksjoner I dette prosjektet ønsket vi å undersøke hvilken effekt bakterier har på vekst, overlevelse, genekspresjon og metabolom hos torskelarver. Vi har tidligere utviklet et system hvor vi kan klekke og holde torskelarver uten bakterier. Torskelarver som har fått leve uten bakterier kan så sammenlignes med torskelarver som vi har gitt spesifikke bakterier -disse kalles gnotobiotiske, da man vet akkurat hvilke bakterier som er tilstede. Torskelarver må ha levende fôr fra rundt 3 dager etter klekking. Tidligere har vi kun foret med bakteriefrie rotatorier, og holdt forsøkene i gang i 17 dager etter klekking. Et delmål var å forbedre systemet vårt slik at vi ha lengre forsøk (opptil 30 dager). For å dekke torskelarvenes økende behov for næring må vi etter hvert da introdusere en større fôrorganisme, Artemia. I 2014 kjørte vi et startforingsforsøk med bakteriefrie, gnotobiotiske og konvensjonaliserte torskelarver. Vi valgte en gram-positiv og en gram-negativ bakterie som ble tilsatt i like mengder i de gnotobiotiske flaskene. Begge bakteriestammene er ikke-patogene og tidligere isolert fra tarmen til torsk. Konvensjonalisert vil si at larvene ble klekket bakteriefrie, men så overført til sjøvann med en kompleks og udefinert bakteriesammensetning. Prøver ble tatt på dag 1, 4, 8, 13, 16 og 21 etter klekking. På dag 17 ble bakteriefrie Artemia neuplii introdusert som fôr, og etter noen dager hadde alle torskelarvene spor av Artemia i magen. Overlevelsen i alle fiskeflaskene var høy, ca. 50 % for torskelarvene som var bakteriefrie eller gnotobiotiske, og 33 % for de konvensjonaliserte. Ingen av de bakteriefrie eller gnotobiotiske fiskeflaskene ble forurenset av bakterier i løpet av eksperimentet. På dag 21 ble forsøket avsluttet da det eksperimentelle systemet vårt (med lav vannutskiftning) førte til en opphopning av raskt voksende Artemia i flaskene, noe vi fryktet ville gi ugunstige effekter på sikt. Vi mener imidlertid at det ikke skal by på problemer å justere protokollen litt slik at forsøkene kan kjøres i 30 dager, som er prosjektets mål. Utviklingen av bakteriesamfunnene i vann og torskelarver ble fulgt ved hjelp av 16S DGGE PCR. Analyser viste at i de gnotobiotiske flaskene og i torskelarvene tok etter hvert den ene av de to tilsatte bakteriene, gram negative Vibrio over, og bare små mengder av den gram positive Microbacterium kunne påvises. I de konvensjonelle flaskene gikk diversiteten gradvis nedover over tid, og mikrobiotasammensetningen ble mer og mer ulik mellom vann og torskelarver. Selv om de bakteriefrie larvene hadde høyest overlevelse, veide de signifikant mindre på dag 16 etter klekking, noe som peker på mikrobiotas rolle i ernæring. Microarray-analyse viste at 436 gener var signifikant ulikt regulert hvis man sammenlignet bakteriefrie, gnotobiotiske og bakteriefrie torskelarver på dag 16 (p<0.05, fold change >1.5). Hvis man teller med mer moderate responser (fold change >1.2) øker dette til over 1500 gener. Gener involvert i vekst og utvikling var høyere uttrykt i fiskelarvene med bakterier, noe som samsvarer med tidligere funn i zebrafisk. Mange av genene med høyere utrykk i bakteriefrie larver er involvert i immunforsvaret, noe som tyder på at mikrobiota i torskelarver kan ha en viktig regulatorisk rolle. I tillegg var gener involvert i fordøyelse (særlig mange proteolytiske enzymer) oppregulert i de bakteriefrie larvene. De gnotobiotiske larvene hadde kun 22 gener som var signifikant ulikt uttrykt i forhold til de bakteriefrie larvene, og var dermed mest ulik de konvensjonelle larvene. Dette kan skyldes den lave diversiteten av bakterier i de gnotobiotiske fiskene, vi har tidligere sett at ulike sammensetninger av bakterier kan føre til ulikt utrykk av vertsgener.

Through the use of gnotobiotic systems (=free of, or containing only known bacteria), the contributions of bacteria on their vertebrate hosts have been confirmed. The overall goal of this proposal is to develop our unique gnotobiotic model for cod (Gadus morhua)larvae to expand our knowledge into the complex interactions that take place between cod larvae and its gut microbiota. The proposals main objectives are system development and host-response detection. Taking advantage of available high-throughput methods for analysis such as a cod specific microarray and non-target metabolomics by UPLC-QTOF MS, we anticipate a significant amount of information from this studies. Increased knowledge into host-microbe interactions in cod larvae may ultimately lead t o improved strategies of microbial management and higher survival of intensively reared larvae. These improvements could positively affect both the financial and resource management aspects of larval rearing.