Improving diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by implementation of a sensitive and specific assay in routine tuberculosis diagnostics

Mangel på tilfredsstillende diagnostikk er et hinder for global kontroll av tuberkulose (TB). I de fleste tilfellene oppstår sykdommen i lungene, men TB kan ramme alle kroppens organer. TB i andre organer enn lungene (ekstrapulmonal) utgjør 14-40 % av alle tuberkuloseinfeksjoner, og er en stor diagnostisk utfordring. Rutinediagnostikk er langsom (dyrkning tar opptil 6-8 uker), og fanger opp for få tilfeller av TB. Dette fører til forsinket diagnose, feil behandling og økt sykelighet og dødelighet. På Universitetet i Bergen (UiB) har vi utviklet en immunokjemi basert test for ekstrapulmonal tuberkulose. Tidligere studier har vist at testen er rask, robust, sensitiv og spesifikk. Testen baserer seg på deteksjon av det utskilte mykobakterielle antigenet MPT64 i væsker, aspirater og biopsier. Den har sensitivitet og spesifisitet som er sammenliknbar med langt mere ressurskrevende tester som nested-PCR. At den nye testen er robust og enkel gjør at den egner seg svært godt for implementering i lav- og middel-inntekts land, hvor hovedtyngden av tuberkulose pasienter befinner seg. I dette prosjektet har man foretatt implementerings- og valideringsstudier i rutine diagnostikk. Testen har blitt implementert i rutine tuberkulose diagnostikk ved fem forskjellige sentre i fire forskjellige land. Studiestedene har blitt valgt for å sammenlikne områder med høy og lav prevalens av TB og HIV. Annen hovedmålet med dette prosjektet er å ytterligere forbedre testen ved utvikling av funksjonelle monoklonalt antistoff. Resultatene: 1) Arbeidet med utvikling av et funksjonelt monoklonalt antistoff har møtt flere utfordringer. Det er prøvd forskjellige metoder for generering av mykobakteriell antigen, og ulike adjuvans for immunisering. Etter fire forsøk har vi tre kloner og renset funksjonell monoklonale antistoffer, som virker godt med ELISA, men ikke med immunohistokjemi på formalin-fiksert biopsier. Dermed har vi fokusert på reproduksjon av funksjonelle polyklonale antistoffer og laget nye antistoffer som virker med immunohistokjemi på formalin-fiksert biopsier. MPT64test med de nye antistoffene har sensitiviteten og spesifisiteten på henholdsvis 87% og 80% ved validering på et lite antall (n = 75) kliniske biopsier. Vi har laget disse antistoffene i stort volum, og gjort tilgjengelig for offentlig bruk gjennom en non-profit plattform Ximbio (https://ximbio.com/reagent/ 157698 / anti-mpt64-antibody2), i samarbeid med teknologioverføring plattformen VIS (https://www.visinnovasjon.no/). Disse antistoffene blir testet på det større pasientmaterialet som er samlet inn i de rutinemessige diagnostikk i India og Pakistan. 2) Arbeidet med implementering av testen (ved de tidligere anti-MPT64-antistoffene) i rutine diagnose ved de sykehusene i Zanzibar, Tanzania, Pakistan og Norge, er fullført. Data analyse for gjennomførbarheten til implementeringen og validiteten til testen i rutine diagnostikk er ferdig for Zanzibar og Norge og pågår fra andre studiestedene. Resultatene til nå viser at det er en betydelig forsinkelse i diagnostisering og behandling av ekstrapulmonal TB som fører til økt sykelighet og dødelighet. MPT64testen er robust, lar seg implementere i rutinediagnostikk i lavressurs-setting, viser betydelig bedre sensitivitet og spesifisitet enn rutinetestene og Xpert MTB/RIF. Nytten av testen er spesielt bra i høy TB endemiske land og kan bidra til rettidig og bedre diagnose av TB. MPT64testen med de nye antistoffene har sammenlignbar sensitivitet, men noe mindre spesifisitet sammenlignet med det forrige antistoffet. Imidlertid er disse resultatene basert på et mindre materiale, og resultat fra større materiale forventes å gi en mer presis validering av de nye antistoffene. Resultatene fra dette prosjektet er publisert som syv artikler i de internasjonale tidsskriftene, et manuskript er under revidering og flere manuskripter er under arbeid. Prosjektet vil resultere i seks doktorgrader og tre masteroppgaver. Veiledning av PhD, mastergrad kandidater og opplæring til laboratoriepersonell forventes å føre til den akademiske og tekniske kapasitetsbyggingen på hver lavressurs område. Gjennom tilgjengeligheten av anti-MPT64 antistoffene kan testen brukes av ethvert laboratorium for diagnostisering av tuberkulose. Samarbeidende institusjoner: Norge: Universitetet i Bergen, Haukeland universitetssykehus, Oslo universitetssykehus, Stavanger universitetssykehus. Tanzania: National Institute for Medical Research, Muhimbili National Hospital, Mbeya Zonal Referral Hospital Zanzibar: Mnazi Mmoja Hospital India: Ujjain Charitable Hospital & Research Center Pakistan: National & Provincial Tuberculosis Control Programme, Gulab Devi Chest Hospital, Shaukat Khanum Memorial Cancer Hospital & Research Center, Social and Health Inequalities Network. Dette prosjektet er finansiert av GLOBVAC og er en del av EDCTP2-programmet støttet av Europaunionen.

The MPT64test is robust, better than the routine tests, and implementable in the routine diagnostics. This test can contribute towards timely and better diagnosis of TB particularly in the high-TB endemic settings. The results have been published as seven original papers, and several manuscripts are under construction. The project will result in six PhD, three master theses, and technical capacity building. Through the availability of the antibodies, the test can be used by any laboratory. Impact: TB related research is highly prioritized among the major global stakeholders (WHO/StopTB Partnerships) as an effort to reduce poverty and improve the economic and social well-being. Lack of accurate diagnostic tools has been identified as one of the major hindrances towards global TB control. The proposed MPT64test will contribute towards achieving a healthier society by improving the health of children, mothers and adults who are the most economically productive age-group and caregivers.

Extrapulmonary tuberculosis (TB) accounts for approximately 14-40 % of all TB infections, and diagnosis is difficult due to paucibacillary nature of the disease. We have developed a rapid, robust, sensitive and specific immunochemistry-based assay to diag nose extrapulmonary TB by detection of the secreted mycobacterial antigen MPT64 from fluids, aspirates and biopsies. Using Mycobacterium tuberculosis complex specific nested-PCR as gold standard the sensitivity and specificity of the assay is up to 95%, s ignificantly better than acid-fast staining and culture (sensitivity of 12% and 22% respectively). The assay can differentiate between pathological and atypical mycobacteria and performs equally well in HIV co-infected patients. Lower costs and robustness makes it suitable for implementation in TB endemic countries. The main objective of this project is to improve the assay by producing a functional monoclonal antibody, implementation and validation of the assay in routine diagnostic settings, and compare the assay with the WHO endorsed Xpert MTB/RIF automated molecular assay. A hospital implementing WHO endorsed DOTS strategy and a pathology laboratory will be selected from each of the 5 sites; Tanzania, Zanzibar, India, Pakistan, and Norway. All consecu tive TB suspects (minimum 400 cases) will be enrolled for one year. Clinical data and samples will be collected. The assay will be performed in addition to the routine diagnostic work-up on all samples. This cohort will be followed up from diagnosis to th e completion of treatment. Response to treatment will define a TB case. Interviews, pre-designed questionnaire, and data from two comparable control hospitals from each site will be used to measure the outcomes which includes validation of the test, feasi bility of implementation, increase in case detection of adults and childhood TB, and cost effectiveness analysis for future scale-up. This assay has a great potential for improving the diagnosis of extrapulmonary TB.