Medications during pregnancy: effects on neurodevelopmental disorders in childhood and epigenetic outcomes

Medisinbruk i svangerskapet: effekter på nevroutvikling hos barnet og epigenetiske utfall Legemidler markedsføres uten nok kunnskap om sikkerheten ved bruk i svangerskapet og potensielle konsekvenser for barnet. Flere store epidemiologiske studier har avdekket sammenhenger mellom mor bruk av vanlige legemidler som paracetamol og antidepressiva i svangerskapet og nevroutviklingssykdommer (for eksempel ADHD). I dette prosjektet, som er en del av PharmaTox (www.mn.uio.no/farmasi/english/research/groups/pharmatox/), forskes det på mekanismene som kan være involvert. Hovedhypotesen er at legemidler påvirker epigenetiske modifiseringer som DNA metylering. Slike epigenetiske modifiseringer er sentrale under fosterutviklingen og differensiering av celler gjennom reguleringen av aktiviteten til gener. Fosterutviklingen ansees som en spesielt sensitiv periode for påvirkning av legemidler. Prosjektet har som hensikt å undersøke hvorvidt medisinbruk i svangerskapet kan påvirke DNA metylering hos barna. Nylig publiserte vi en studie der vi fant forskjeller i DNA metylering hos barn med ADHD som har vært eksponert for langvarig bruk av paracetamol i svangerskapet (mer enn 20 dager). Disse analysene ble utført i navlestrengsblod fra barn i den norske mor og barn studien (MoBa). Det er ikke mulig å trekke noen kausale konklusjoner fra sammenhengen vi finner i MoBa. I den neste fasen av prosjektet ønsker vi å studere effekten av paracetamol i en human embryonal stamcellemodell. Ved å eksponere stamceller for legemidler kan vi studere hvordan dette påvirker DNA metylering og genuttrykk under differensieringen av stamceller til nevroner. Vi er godt i gang med å etablere denne modellen i laboratoriet og resultatene fra disse studiene vil være viktige for den kausale fortolkningen av sammenhengene vi finner i MoBa. Differensiering av embryonale stamceller involverer forskjellige utviklingsstadier av celler med ulike epigenetiske modifiseringer og genuttrykk. Dette vil potensielt konfundere DNA metylerings ? og ekspresjonsanalyser analyser, og en sentral del i etableringen av denne stamcellemodellen har vært å karakterisere og kartlegge cellesammensetningen/stadier fra stamceller til nevroner. I dette arbeidet er vi i gang med å sekvensere enkeltceller (såkalt single-cell sequencing, 10x Genomics). Disse resultatene vil gi en bred og fullstendig kartlegging av alle celletyper og stadier i differensieringen. Disse dataene vil være helt essensielle i fortolkningen av resultatene vi finner ved eksponering av stamceller for paracetamol og andre legemidler, og vil publiseres i en egen metodeartikkel. Det er kjent at DNA metylering er korrelert mellom nærliggende posisjoner i DNA sekvensen (DNA metyleringens korrelasjonsstruktur). Korrelasjonsstrukturen er ofte ignorert i statistiske analyser av forskjeller i DNA metylering. Å inkludere informasjonen om korrelasjonsstruktur i analysen kan potensielt øke styrken til studien. Dette studerer vi gjennom modellering av korrelasjonsstrukturen ved å bruke et rammeverk som allerede eksisterer (Bayesianske regresjonsverktøyet, Integrated Nested Laplace Approximations), men som ikke er brukt til slike analyser før. For å bedre forståelsen av mekanismene rundt korrelasjonsstrukturen modellerer og undersøker vi assosiasjonen til forskjellige kovariater. Dette er blitt gjort på et stort datasett (1200 prøver) fra en finsk kohort. Siden kovariater som alder, BMI og røyking er assosiert med DNA metylering så er disse analysene viktige for å identifisere kovariater man bør kontrollere for når man undersøker forskjeller i case-kontroll studier. Foreløpige resultater viser at korrelasjonsstrukturen er assosiert med alder. Videre analyser vil undersøke andre kovariater og om dette kan replikeres i andre datasett. Vi planlegger vi å bruke denne statistiske modellen til å identifisere forskjeller i metylering mellom barn utsatt for paracetamol med ADHD mot ueksponerte friske barn.

Contribution to the research field 1. Developed a reference data set for cord blood DNAm. This is available as a package in R and used widely by the community. In addition, paper describing advice for the community for using reference data sets. 2. Demonstrated a link between newborn DNA methylation, ADHD and paracetamol intake, the first time this has been shown. 3. Development of a new statistical method for analysing DNAm data. 4. Review and recommendations for EWAS studies. 5. Paper describing the challenges with replication in epignome-wide association studies. 6. Development of a protocol to differentiate human embryonic stem cells (hESCs) to neuronal cells. Provide open access web tools for data analysis. This protocol will be valuable for the assessment of drug toxicity and basic research in early neuronal development. Interdisciplinary research The project was very interdisciplinary, consisting of 13 directly involved researchers with diverse backgrounds including genetics, epigenetics, pharmacy, cell biology, neuroscience, data science, and clinical fields. These researchers are based at 8 different departments in Norway (Oslo University Hospital, University of Oslo and Norwegian Institute of Public Health. It also included two collaborators based at Karolinska in Sweden. Societal impact 1. Pregnant women are not included in randomized clinical trials due to ethical considerations and thus medications are marketed without sufficient information on safety during pregnancy. Our demonstration of a link between DNA methylation, paracetamol use during pregnancy and ADHD, has clear implications for women and children. We are currently analysing data for antidepressants in a similar study design. It should be noted that studies such as these are a very active area of research with the scientific community. 2. Development of an ES cell protocol for the study of neuronal development. This hESC model can be used to screen other pharmaceuticals commonly used during pregnancy. The development of this methods has great potential for to extend the use of in vitro methods (ie not animal-based) to assess drug toxicity in neurodevelopment.

Pregnant women are not included in randomized clinical trials due to ethical considerations and thus medications are marketed without sufficient information on safety during pregnancy. Currently, more than 250 000 children are diagnosed with neurodevelopment delays in the EU region each year. Why? Is there a link? We hypothesize that medications prescribed during pregnancy may play an unrecognized role in the development of neurodevelopmental disorders, such as delayed psychomotor development and attention deficit hyperactivity disorder (ADHD). Several studies provide the proof of concept that DNA methylation patterns from blood samples in newborns may serve as early markers for long-term neurobehavioral disorders. Furthermore, lower DNA methylation in newborns was recently linked to more ADHD symptoms in 6-year-old children. These initial human findings requires replication, but if proven correct, suggest that exposure to psychotropic medications may be associated with specific measurable DNA methylation profiles in newborns and that these may be used as early biomarkers of neurodevelopmental disorders, enabling early interventions. Using data and samples from the Norwegian Mother and Child cohort (MoBa) we will investigate the link between medications taken during pregnancy, epigenetics and neurobiological outcomes.The size and richness of the available questionnaire data and biological samples from more than a hundred thousand pregnancies, and linkage to large patient registries, makes this project unique. Only large prospective cohort studies like this can measure the small effect sizes associated with epigenetic changes. The final outcome will be fundamentally new knowledge about how medications affect the developing unborn child and provide opportunities for future research in a new field of pharmacoepigenetics. The implications will not only be for how we treat pregnant women, but how we use pharmaceuticals in any patient population.