Hydrogenperoksidresistens i lakselus (Lepeophtheirus salmonis)

På tross av en sterk økning i bruk av ikke-medikamentelle metoder er norsk laksoppdrett fortsatt avhengig av kjemiske midler for å holde lusenivået under det maksimale nivået på 0,5 voksne hunner per fisk. Hyppig bruk av et begrenset antall kjemikalier har ført til resistens. Hydrogenperoksid har lenge vært "siste sjanse" blant kjemikalier for kontroll av lakselus. Dette prosjektet er et samarbeid mellom en bioteknologi firma (PatoGen AS), et universitet (NMBU, Veterinærhøgskolen), en fiskehelsetjeneste (Aqua Kompetanse AS) og to oppdrettsselskaper (Marine Harvest AS og Sinkaberg-Hansen AS). Kort før prosjektets start fant NMBU at motstand mot H2O2 var forbundet med økt ekspresjon av enzymet katalase i resistente populasjoner. RNAseq-undersøkelser av H2O2-sensitive og H2O2-resistente parasitter viste at i tillegg til genet som koder for katalase er uttrykket av andre gener er også korrelert med resistensnivået. Dette er gener for sårhelingsfaktorer, faktorer som forbedrer parasittens evne til å takle oksidativt stress, samt noen nedregulerte gener som koder for transportproteiner. RNAseq-data viste at ekspresjonen av katalasegenet blir indusert av H2O2-eksponeringen slik at nivået øker raskt. Dette gjør overvåking i felt utfordrende når man kun bruker katalase som markør. I 2018 ble det verifisert at ett av de andre genene ikke ble påvirket av eksponering for H2O2. Det var derfor interessant å undersøke om dette var en god tilleggsmarkør for H2O2-resistens. En rekke prøver av ulike lakselusstammer ble undersøkt for kovariasjon av dette genets ekspresjon med H2O2-følsomhet målt med bioassays. Samvariasjonen var utmerket, og sammen med ekspresjonen av genet for katalase ga disse to markørene en utmerket prediksjon av lusas følsomhet mot H2O2. Laboratorievalideringen ble utført ved NMBU, mens PatoGen har utviklet et Taq-Man assay som kan brukes kommersielt og startet med å validere assayet på feltmateriale. PatoGen har i 2018 jobbet for å få dette funnet patentert og vil inkludere den i sine tjenester. NMBU skriver p.t. sammen resultatene til en publikasjon som er planlagt innsendt til et fagfellevurdert tidsskrift våren 2019. I prosjektet er det også undersøkt hvilke atferdsmessige og fysiske endringer som lakselusa gjennomgår når den blir utsatt for H2O2. Disse ble dokumentert i 2018 ved hjelp av bioassay, videoopptak, histologiske- og kjemiske undersøkelser. Resultatene viste at ved å øke H2O2 konsentrasjoner og / eller eksponeringstid blir normal oppførsel, som svømmeevne og tilhefting til fisk, først berørt. Lusa slipper taket. Samtidig sees gassbobler på utsiden av kroppen. Ved høyere eksponering for H2O2 blir lusa lammet og gassbobler sees inne i kroppen. Disse boblene fører til at lusene flyter opp og indre organer skades. Analyser viste at disse boblene er oksygen. Effektene var de samme i følsomme og resistente parasitter, men ble først indusert ved vesentlig høyere konsentrasjoner i resistente parasitter. NMBU skriver p.t. sammen resultatene til en publikasjon som er planlagt innsendt til et fagfellevurdert tidsskrift våren 2019. I 2018 ble bioassayet som benyttes i felt for å anslå parasittenes følsomhet gjennomgått og forbedret. Det ble spesielt undersøkt om temperaturen i eksponeringsløsningen påvirket bioassayresultatet, noe som viste seg å ha svært stor betydning. Selv 1-2 graders avvik fra nominell temperatur på 12 grader ga betydelig utslag på resultatet, ved at flere parasitter døde ved høyere temperatur og færre ved lavere, selv om H2O2-konsentrasjonen var lik. Eksponeringsløsningene må altså være gjennomtempererte når parasittene eksponeres for H2O2 i bioassays. Protokollene som brukes er oppdaterte på dette punktet. For andre bioassays (azametifos, pyretroider, emamektin) hadde ikke 1-2 graders temperaturforskjell noen betydning. I tillegg har PatoGen har i 2018 jobbet for å implementere sine molekylærbiologiske assays på lakselus i et større prediksjonsverktøy for lakselussmitte, merdvariasjoner, resistensspredning og behandlingseffekt. Målet er å kunne forutsi effekt av mange ulike tiltak mot lakselus i enkeltanlegg og regioner, både på både kort og lengre sikt. Modelleringsarbeidet har vært gjort av Norsk Regnesentral. Det forventes at dette blir et viktig verktøy i fremtidig integrert lakselusbekjempelse (IPM). I 2018 har det ikke vært hydrogenperoksidbehandlinger egnet for spesiell oppfølging i deltakende oppdrettsselskaper, Marine Harvest Norge og Sinkaberg-Hansen. Dette har skapt noen problemer for validering av laboratorieresultater i felt. Marine Harvest har imidlertid fått analysert en rekke prøver fra sine anlegg for resistensmarkørene. Disse dataene har vært verdifulle i valideringen, og har i tillegg, sammen med data fra tidligere år, blitt brukt til et manuskript rundt nedgang i følsomhet mot H2O2 fra 2013 til 2018. Dette manuset er klart for innsending til et tidsskrift med fagfellevurdering.

- De molekylære assays benyttes i stor grad av selskaper og fiskehelsetjenester i planlegging av kontroll med lakselus. Interessen fra andre land er stor, de benyttes allerede i Skottland, Færøyene og Canada, og skal lansert i Chile i 2019 - Bioassays for resistenstesting er forbedret. Testene brukes i Mattilsynets OK-program. Forbedringen gir sikrere resultater - Mattilsynets OK-program for lakselusresistens gir et unikt bilde av sensitivitetsstatus i Norge. Det benyttes både molekylære tester og forbedrede bioassaytester. Resultatene gir bedre planlegging av tiltak fra myndighetenes side - Impementeringen av testene i et større modelleringsverktøy for smittepress, spredning av resistensfaktorer og optimal kontroll forventes å bli meget nyttig for oppdrettere, fiskehelsetjenester og myndigheter når det lanseres i 2019 - PatoGen har etablert seg som den eneste leverandør av molekylære hurtigtester for resistens hos lakselus, både nasjonalt og internasjonalt

Norsk lakseoppdrett er foreløpig avhengige av kjemisk avlusing for å holde lusetallet nede på det myndighetsbestemte nivået. Hyppig bruk av få midler har ført til at lakselusa har utviklet resistens mot de fleste av de kjemikaliene som er tilgjengelig i dag. Dette gir store utfordringer for oppdrettsselskapene, i verste fall kan de bli tvunget til forsert utslakting. Hvis kontrollen på lusetallet tapes utsettes fisken for en helsepåkjenning og smittepresset til omkringliggende anlegg og villfisk øker. Hydrogenperoksid som lusemiddel har noen ulemper, det er kostbart å bruke, det angriper bare de bevegelige stadiene av lakselusa og sikkerhetsmarginen i forhold til toksisk dose er begrenset, og krymper jo varmere vannet er. Fram til nylig var det ikke registrert resistens mot hydrogenperoksid, dette midlet har derfor vært «the last man standing» i enkelte resistensutsatte områder. I 2012 begynte det å komme rapporter om enkelttilfeller med redusert behandlingseffekt. NMBU Veterinærhøgskolen utviklet i samarbeid med Aqua kompetanse AS en bioassaymetode som kunne skille mellom lakselusstammer med ulik sensitivitet mot hydrogenperoksid. Denne resistenstesten ble så brukt på en stamme som hadde vist redusert behandlingseffekt, og denne stammen hadde en sensitivitet som var 10 ganger lavere enn en fullt ut sensitiv stamme. Avkommet til den resistente stammen viste den samme høye resistensen som sine foreldre, egenskapen er derfor arvelig. Innledende studier har også blitt utført for å finne de molekylære mekanismene som ligger bak. De første resultater tyder på metabolske faktorer som årsak, og et første-generasjons assay er utviklet, selv om den egentlige genetiske "signatur" enda ikke er identifisert. Dette prosjektet tar sikte på å finne denne, utvikle et andre-generasjons molekylært assay og sette dette inn i en systematisk plan for overvåking av resistens og bekjempelse av lakselus.