Natures Creation of non-Random Structures: Molecular Mechanisms for Processivity and Specificity of Polysaccharide Modifying Enzymes

Alginater er et langkjedete karbohydrater som hovedsakelig kommer fra tare. Alginat består av to sukkerenheter, mannuronsyre og dens speilbilde guluronsyre, heretter omtalt som M og G. Alginat har evnen til å danne geler ved å binde positivt ladede ioner som kalsium. Repeterende strekk med G-enheter (kalt G-blokker) har denne egenskapen, mens MG- og MM-delen ikke har denne evnen. Fordeling og lengden på G-blokkene har stor betydning for alginatets egenskaper, og dermed anvendbarheten som biomateriale. Sammensetningen av alginatet kan endres ved å bruke alginat-epimeraser, en familie av enzymer som kan endre M til G. Vi har begynt å studere samspillet mellom alginat og epimeraser. Her bruker vi resultater fra mutant enzymer som input til computer simuleringer og vise versa for å generere kunnskap og designe nye enzymer. For øyeblikket er vi i ferd med å fullføre tre historier for to av epimerasene fra familien for å forstå deres forskjellige epimeriseringsmønster. For AlgE4 er ladede aminosyrer i kombinasjon med hydrofobe aminosyrer ansvarlige for at to av sukkerenhetene beveger seg per katalytisk hendelse, noe som resulterer i vekslende alginatstruktur med annenhver M og G. AlgE4 har bevegelige sløyfer som kan lukkes over substratet som styres av den elektrostatiske interaksjonen. I tillegg har enzymkinetikken til AlgE4 blitt karakterisert ved hjelp av tidsoppløst NMR-spektroskopi. Her kan vi se på substratforbruk og produktdannelse samtidig slik at vi kan gjøre rede for hele prosessen som pågår i den katalytiske hendelsen. Den siste historien handler om AlgE7, et enzym som har to aktiviteter og som fungerer både som en epimerase og lyase samtidig. Her har man identifisert viktige aminosyrer som er ansvarlig for interaktivt lyase-aktivitetssted. Dette har også gjort det mulig for oss å foreslå den katalytiske mekanismen for denne familien av enzymer.

On a general basis the knowledge that has been generated in the project also relevant for several other projects listed below: -OligoDSP (RCN) -MucusAlg (RCN) -SBP-N The Norweigan Seaweed Biorefinery Platform (RCN) -SFI-IB Industrial Biotechnology (RCN) On a more specific note this project has been the fundament for two new projects: -AlgModE - Alginate Modifying Enzymes (RCN) -WPAC -Structure and Design of Whey Protein Alginate Complexes (Novo Nordic Foundation). During the project two new important international collaboration has been established: -Dr. Sergey Samsonov, University of Gdansk, Poland. -Prof. Birte Svensson and Assist. Prof. Casper Wilkens, Technical University of Denmark, Denmark. Other result is the Post Doc in the project has now obtained a permanent position as an assoc. Prof at the Institute of Chemistry at NTNU. The PhD has been offered at least one year of Post Doc at Dr. Sergey Samsonov, Faculty of Chemistry, University of Gdansk, Poland.

This project will use competence and technology established during three decades of research to explore the basic mechanisms underlying the processivity and specificity of a family of enzymes called mannuronan C-5 epimerases acting on the polysaccharide alginate. Alginates are linear, non-random copolymers of mannuronic acid (M) and its C-5 epimer guluronic acid (G). Alginate is synthesised as poly-mannuronan which is then converted into alginate by the epimerase enzymes. The hypothesis is that the plethora of non-random structures found in alginate is a consequence of epimerases with different degrees of processivity. The mode of action of these enzymes will be elucidated through combining computational enzyme design with advance experimental approach including three-dimensional (3D) structure determination, characterisation of enzyme activities, and determination of single molecular interactions between the enzymes and substrates with precisely defined structure and composition. The epimerases represent a unique model for understanding other enzymes involved in biosynthesis of polysaccharides with non-random block structures, e.g. heparin and heparan sulphate. The consortium includes Dep. of Biotechnology and Dep. of Chemistry at the Norwegian University of Science and Technology and SINTEF Materials and Chemistry. The partners hold extensive experience in biopolymer synthesis, modification and characterization, computational chemistry, production and utilization, biomolecule interaction studies, and overall protein structure determination. Furthermore, the consortium will seek active collaboration with their international partners, especially Roscoff Marine Station, University of Amsterdam and Umeå University. Together, this knowledge base combined with the partners state-of-the art infrastructure and research network renders the consortium well-suited to accomplish the challenging objectives set forth in the proposal.