Implications of green fish feed for consumer safety - carry-over of plant peptides, natural toxins and bioactive compounds

Fôr for oppdrettsfisk lages i dag hovedsakelig med planter som utgangsmateriale fordi det ikke finnes nok råstoffer fra havet for å tilfredsstille det økende behovet. Hvete og erteblomstvekster som soya og erter brukes ofte i fiskefôr. Denne endringen kan ha betydelige konsekvenser både for fisken og for konsumenter av fiskebasert mat. Fiskenes behov for næringsstoffer blir dekket ved innovative fôrsammensetninger. Mulige effekter på konsumenter av fisk er imidlertid lite undersøkt. Vitenskapskomiteen for Mattrygghet (VKM) hadde konkludert i en nytte- og risikovurdering av fisk i norsk kosthold med at det fantes kunnskapshull angående mulig overføring av planteinnholdsstoffer fra fôr til fisk til mennesker og hvilken risiko for human helse dette kan innebære. SafeFish-prosjektet hadde derfor som mål å undersøke om typiske planteinnholdsstoffer kan overføres fra fôr til mat. Tre forskjellige grupper av substanser ble analysert: potensielt allergifremkallende fragmenter av planteproteiner (peptider), giftstoffer produsert av sopp som vokser på planter (muggsoppgifter) og planteproduserte stoffer som ligner hormoner i mennesker (planteøstrogener). Vi lagde fiskefôr som inneholdt spesifikke andeler hvete, soya eller erter. Forsøksfôret ble brukt i fôringsstudier med sebrafisk og oppdrettslaks i vekstfasen. Fiskene ble analysert med forskjellige metoder for potensielt overført planteingredienser for å kunne vurdere risikoen for human helse og for å se på mulige fysiologiske forandringer i fisk. Vi detekterte muggsoppgifter, planteøstrogener og proteiner med massespektrometri,fysiologiske forandringer i fisk med DNA- og RNA-teknologi og immunologiske undersøkelse av plante-fôret fisk med sera fra pasienter med matallergi. Prosjektet var et samarbeid mellom spesialister ved to norske forskningsinstitutter, to norske universiteter, et norsk universitetssykehus og et US-universitet og inkluderte en PhD-stipendiat stilling. Prosjektet hadde oppstart i sommer 2016. Årlige prosjektmøter ble gjennomført for å diskuterer strategier, fremgang og presentasjon av resultater. Prosjektets fremgang gikk som planlagt. Kjemiske og proteomiske analysemetoder ble utviklet for de forskjellige analyttene. Spesialfôr ble laget og fôringsforsøkene i sebrafisk og laks gjennomført. Alle fiskeprøver ble analysert for mykotoksiner og planteøstrogener uten å finne mengder som kunne utgjøre en fare for konsumenter. Resultatene har blitt publisert i tidsskriftet «Toxins». Et in vitro system for nedbrytning av fremmedstoffer med lakeleverpartikler (som første i verden) ble utviklet og brukt for å karakterisere metabolitter til planteøstrogener i fisk. Det viste seg at laksen avgifter østrogenene gjennom kobling til en type sukkermolekyler (glukuronidering) og at det er derfor lite sannsynlig at konsumenter av fiskeprodukter bli eksponert. Resultatene har blitt publisert i tidsskriftet «Ecotoxicology and Environmental Safety». En ny metode til å nedbryte gluten med forskjellige fordøyelsesenzymer ble utviklet og brukt i prøveforberedelse til massespektrometriske analyser av fisk som har fått mye gluten i fôr. Samtidig ble sera fra pasienter med allergi til hvete brukt for å detektere rester av gluten i eksponert fisk. Forsøkene viste at overføring av veldige lave mengder glutenpeptider til fisk kan være en mulighet. Bekreftede tilleggsforsøk ble gjennomført og resultatene publisert i 2021. DNA- og RNA-teknologi ble brukt i veldig omfattende forsøk for å detektere mulige forandringer i laks og sebrafisk som hadde fått plantebasert fôr. Vi fant at spesielt fôr med mye gluten aktiverte spesifikke gener i muskler til sebrafisk og laks som står i forbindelse med inflammatoriske reaksjoner. Resultatene har blitt publisert i tidsskriftet «Frontiers in Genetics». Effekter på tarm og lever i laks ble også analysert. Resultatene er publisert i tidsskriftet «Genes». Ytterligere resultater på genetiske forandringer i sebrafisk milt og på epigenetiske forandringer i laskelever ble publisert i 2021. Resultatene ble i tillegg presentert på flere nasjonale (f.eks. Havbruk) og internasjonale konferanser. Doktorgradsstipendiaten som var tilknyttet prosjektet disputerte den 4.12.2020 ved NMBU og oppnådde PhD graden. Prosjektarbeidet ble avsluttet med et (digitalt) sluttseminar med deltagelse av prosjektpartnerne. Projekt sluttet den 31.12.2020.

No risk for consumers of fish produced with three plant-based feeds was found regarding allergenic peptides, mycotoxins and phytoestrogens, but a negative impact on fish health is possible, especially from enteropathological inflammation. Specific outcomes: - Development of 25-in-1 LC-HRMS/MS suitable for analysis of mycotoxins and phytoestrogens in feed and fish. - Simultaneous characterisation of 5 major CYP P450 and 5 major UGT enzymes in liver fractions using specific substrates and LC-TripleQ-MS/MS analysis. - Establishment of generally applicable salmon in vitro biotransformation assays using primary hepatocytes or liver microsomes. - Novel sequential protease digestion method for wheat gluten sample preparation in proteomics. - Development of label-free semi-quantitative nLC-nESI-MS/MS and quantitative LC-TripleQ-MS/MS for proteomics of gluten peptides in feed and fish. - Workflows for the nutrigenomic and nutriepigenomic analysis of different fish tissues.

The continued growth of Norwegian aquaculture depends on the utilisation of new, sustainable protein resources for fish feed since marine reserves are limited. The last decade has seen a tremendous transition from marine to agricultural feed materials, which currently make up to 70 % of the aquafeeds used in Norwegian salmon farming. Commonly used are protein preparations derived from wheat and legume plants, mostly soy and pea. This complete change in the diet of fish has led to new challenges regarding fish health and welfare, and product quality. Many initial problems have been solved by extensive research on feed processing methodologies and feed compositions. The Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM) has, however, recently pointed out in an updated benefit-risk assessment of fish and fish products that plant ingredients may introduce new contaminants into feed, which could be transferred into the eatable portion of fish and might be a risk for consumer safety. The SafeFish project attempts to fill this data gap by determining the carry-over potential of three typical constituents of plants: plant peptides (stable fragments of plant proteins), mycotoxins (products of fungi infections), and hormone-like compounds (phytoestrogens). Custom-made feedingstuffs containing different amounts of typical plant protein preparations will be used in studies in a zebrafish model and in on-growing salmon. Fish muscle and organs will be analysed with a multitude of analytical methods (proteomics, chemical analysis, fish nutrigenomics, fish transcriptomics, immunochemical assays including test with food allergic patients) to study effects on fish physiology and substance carry-over, and finally to access consumer health risk. This multi-disciplinary project involves the collaboration of two Norwegian research institutes, two Norwegian universities, a Norwegian university hospital and one university in the USA, and includes the training of one PhD student