Multiple routes to B cell memory in Atlantic salmon

Virussykdommer utgjør en stor trussel for norsk oppdrettslaks og dagens kommersielle vaksiner gir begrenset beskyttelse. For å utvikle bedre virusvaksiner må vi forstå hvordan laksens immunforsvar fungerer og hvilke mekanismer som bidrar til langvarig beskyttelse. De fleste vaksinene på markedet består av inaktivert virus og blir gitt via injeksjon i bukhula. Disse induserer produksjon av antistoffer som kan blokkere videre infeksjon. Det er aktiverte B-celler, kalt plasmaceller, som skiller ut disse antistoffene. Hos pattedyr kan plasmacellene leve lenge og bidra til langvarig beskyttelse. Om dette skjer i laks vet vi lite om. Hovedmålsetning for prosjektet har vært å øke kunnskapen om B-celleresponser rettet mot virus i laks. Delmål har vært å kartlegge B-celle populasjoner i laks, hvordan disse fordeler seg i immunologiske organer, samt laksens antistoffrespons etter vaksinering eller smitte. Siden de fleste vaksiner som brukes i laks injiseres i bukhula har vi sammenlignet lokale B-celle responser i bukhula versus det som skjer i systemiske immunorganer som fornyre og milt. Systemiske og lokale B-celle responser ved intraperitonal injeksjon av Salmonid alfavirus (SAV) eller inaktivert SAV. For å studere systemiske og lokale B-celle responser har vi gjort to forsøk med både levende SAV og inaktivert SAV helvirus administrert i bukhula (IP) og fulgt fisken i opptil 21 uker. For dette formålet har vi etablert ELISPOT-som målemetode for å påvise B-celler som produserer IgM. I begge forsøkene påviste vi en langvarig tilstedeværelse av plasmaceller i bukhula i den SAV-infiserte fisken, mens responsen i de systemiske organene milt og hodenyre var mindre uttalte (Jenberie et al 2020, Jenberie et al 2022). Nivået av plasmaceller i bukhula samsvarte med mengde antistoff i blodet hos fisken. (Jenberie et al 2022). Også plasmaceller som skiller ut spesifikke antistoffer mot SAV ble påvist i bukhula, og frekvensen av disse var høyere her enn i milt og fornyre. Generelt, ga infeksjon med levende virus en høyere respons og med lengre varighet enn inaktivert SAV. Hvilken immunologisk rolle har fettvevet i bukhula? Etter IP injeksjon av bakterien Piscirickettsia salmonis fant vi også en sterk B-celle respons i bukhula tilsvarende den for SAV (van der Waal et al 2021). Resultatene gjorde at vi stilte spørsmålet: Er bukhula en arena hvor B-celler aktiveres lokalt, og finnes det andre typer leukocytter i det omliggende fettvevet som deltar i å igangsette immunresponser? Ved genekspresjonsanalyser av fettvevet fra både P. salmonis og SAV-infisert laks kunne vi påvise uttrykk av gener for ulike leukocytter som B- og T-celler og antigen-presenterende celler. I tillegg ble inflammatoriske og antivirale cytokingener påvist. Vi foreslår derfor at fettvevet i buken er et organ hvor både B-celler og andre leukocytter er til stede, og hvor lokal aktivering av B-celler skjer. Immunologiske hukommelse hos laks? Et annet viktig delmål i prosjektet har vært å undersøke om laksens B-celler har immunologisk hukommelse som gjør at en sekundær respons blir kraftigere og har lenge varighet enn den primære. I det ene SAV-immuniseringsforsøket injiserte vi derfor en booster dose med inaktivert SAV seks uker etter første immunisering. Verken antallet antistoff-produserende B-celler i bukhule og systemiske organer, eller nivået av SAV-spesifikke antistoffer i blodet økte i booster-gruppa sammenlignet med gruppa som fikk kun en dose virus. Vårt forsøk viste ikke en klassisk sekundærrespons hos laks slik denne er beskrevet hos pattedyr. Karakterisering av BAFF og APRIL i laks? og deres samspill med B celler. BAFF og APRIL er to cytokiner som i pattedyr bidrar til overlevelse og utvikling av B-celler. Vi har studert funksjonene til BAFF og APRIL i laks. Ved qPCR-analyse fant vi BAFF- og APRIL-transkripter i mange av laksens organer og disse økte hos den SAV-infiserte fisken, og spesielt i målorganer for viruset. I leukocyttkulturer var nivået av BAFF og APRIL høyest i makrofager, mens ulike BAFF- og APRIL-reseptorer var primært uttrykt i B-celler. Tilsetning av BAFF- og APRIL-proteiner til lakseleukocytter ga økt overlevelse av B-celler i kultur samt økt antall plasmaceller fra perifere blodceller, sammenlignet med ubehandlete celler. Dette viser at nøkkelfunksjoner som er beskrevet for BAFF og APRIL i pattedyr også er til stede i benfisk og begge disse cytokinene er viktige for å holde kultiverte B-celler i live. Identifisering av B-celle markører fra laks for produksjon av antistoffer. Cluster of differentiation (CD) er et system for å identifisere overflatemarkører hos ulike leukocytter. Ved bruk av proteomikk har vi identifisert viktige B-celle overflatemarkører for laks, inkludert CD22 og CD79 (Penaranda et al. 2019).

Effektive virusvaksiner for akvakultur er avgjørende for å forbedre fiskevelferd og lønnsomhet. Skal vaksinene forbedres må vi forstå fiskens immunsystem. For å studere B-celleresponser hos laks har vi utviklet nye metoder og reagenser: ELISpotmetoder for å kvantifisere plasmaceller Proteinene BAFF og APRIL fra laks er produsert og øker overlevelsen til B-celler i kultur Ved proteomikk er overflatemarkører for laksens B-celler identifisert Et videre forskningssamarbeid for å produsere monoklonale antistoffer mot B-cellemarkører som skiller ulike B-cellepopulasjoner er ønskelig. Forskningen har vist at når vaksiner gis i bukhula, vil lokale B-celleresponser være langvarige og bidra til beskyttelse. Når vaksiner som stikkes i bukhula skal testes for beskyttelse, bør smitteagenset ikke gis i buken, men en kohabitant smittemodell bør brukes. Kunnskapen er relevant for vaksineselskaper som driver rutinemessig batchtesting av vaksiner.

Viral diseases like pancreas disease are a main concern in the Norwegian aquaculture industry, and the vaccines on the market give suboptimal protection. B cell memory responses are essential for durable protective immunity after vaccination. The organization of the teleost immune system and its B cell components differ from mammals, and it is likely that these features influence how immunological memory is maintained. It is therefore a need to determine the protective status of vaccines related to elicited B cell responses. However, the components and mechanisms underlying formation of and function of A. salmon B cell memory are still elusive. In this project we propose to study salmon IgM+ and IgT+ B cells, their distribution, and the quantity and quality of B cell memory responses after vaccination. The main question is how and to what extend salmon preserve B cell memory. Our own previous work has shown that a high and long lasting antibody response is induced in vivo using the TLR ligands (CpG/poly I:C) as adjuvants in combination with salmonid alphavirus (SAV) antigen. The antibody levels were significantly higher than with other adjuvants, suggesting that TLR stimulation mediate salmon B cell effector functions. This model will be used as a basis in the proposed project to explore how TLR ligands influence B cell memory and whether B cells of memory and/or plasma cell phenotypes exist in A.salmon. To identify different B cell subpopulations and explore their functions a wide repertoire of state of the art techniques will be employed including proteomics, flow cytometry and RNAseq. If successful, our research will guide the design of future vaccines and also provide a set of valuable tools to measure salmon B cell levels and functions.