ERA-NET: Systems biology platform for the creation of lean-proteome Escherichia coli strains

Den Gram-negative bakterien Escherichia coli er den mest brukte organismen for produksjon av rekombinante proteiner med anvendelser I industri, farmasi, medisin og molekylærbiologiske reagenser. Proteinsyntese er den mest ressurs og energikrevende prosessen i en celle og må derfor optimaliseres for å oppnå maksimal effektiv produksjon av funksjonelle rekombinante proteiner. Det naturlige miljø for E. coli er mye røffere enn de nære optimale vekstbetingelser bakterien opplever i en industriell produksjonsprosess. For sin naturlige livsprosess produserer bakterien mange proteiner som derfor kan betegnes unødvendige i cellen under industrielle vekstbetingelser. I LeanProt prosjektet har målet være å kartlegge og fjerne de mest ressurskrevende vertsproteinene fra E. coli for å frigi ressurser og energi for maksimal produksjon av rekombinante proteiner. Dette bel utført ved en systembiologi drevet metode som inkluderte omics-teknologier, modellering, verts celle fysiologi analyser,og prosess og genetic engineering. Den norske (NTNU) rollen i LeanProt var å designe og konstruere et 3-reporter protein system som muliggjør detaljerte in vivo analyser av mutante E. coli vertstammer. Vi valgte å anvende et bred-spektret replikon for dette formålet for å øke anvendelsespotensialet til å inkludere alle Gram-negative bakterier. En viktig kunnskapsbase under design av dette arbeidet var å skrive en review-artikkel på tilgjengelige relevante genetiske verktøy og denne ble publisert i Microbial Biotechnology (Gawin and Brautaset et al 2017). Egenskapene og anvendelsespotensialet for dette konstruerte 3-reporter systemet ble så demonstrert i E. coli samt 2 andre Gram-negative bakterier og publisert i Microbial Cell Factories (Gawin and Brautaset et al 2018). 3-reporter systemet ble også brukt av våre LeanProt prosjektpartnere for evaluering av øvrige E. coli mutanter konstruert i prosjektet (manuskripter under utarbeidelse). I tillegg til å ha en ledende rolle i generering av E. coli Lean mutante stammer (se ovenfor), har vi også fokusert på målrettet mutagenese av kromosomale gener som koder for proteiner med antatte roller i folding, disulfid-dannelse, og stabilitet av sekreterte rekombinante proteiner i E. coli. Totalt 8 mutanter ble konstruert med endret regulering av slike gener, og testet for forbedret produksjon av sekreterte funksjonelle rekombinante proteiner. For 4 av stammene oppnådde vi signifikante økte produksjonsnivåer av funksjonelle proteiner og dette arbeidet er under publisering (Gawin and Brautaset, manuskript under utarbeidelse). NTNU partner tok rolle som gjeste editor i tidsskriftet Microorganisms for spescial issue "recombinant protein production in Microorganisms" direkte relevant og knyttet til LeanProt prosjektet (Brautaset and Valla, Microorganisms 2019)

LeanProt prosjektet har representert et nytt nettverk av sterke europeiske partnere vi (NTNU) ikke har hatt samarbeid med før innenfor system biologi. Særlig har samarbeidet mot partnere i Latvia og Tyskland fungert veldig bra med god utveksling av biologiske materialer, metoder og co-publiseringer. Disse nettverkene vil vi beholde for fremtidige nye søknader. Rekombinant protein produksjon er et stort og viktig felt og resultatene oppnådd i prosjektet har betydelighet for bedre design av selve vertstammenn, samt bedre systemer for å evaluere dem. Vi har opparbeidet ny forståelse innenfor verts-egenskaper som er avgjørende for folding og produksjon av sekterete proteiner i E. coli. Dette er kunnskap og teknologi av industriell interesse. NTNU har lang erfaring innenfor rekombinant protein produksjon og deltagelse i leanProt har tatt dette videre og i nye spennende retninger.

LEANPROT aims to develop an iterative systems biology-based strain engineering platform based on a novel approach of proteome optimization in iterative cycles of modeling and biological experiments which carries a substantial potential for addressing the aforementioned challenges in bioprocess development. That potential arises from the fact that cells express proteins unnecessary for growth under well-controlled optimal conditions, typically realized in biotechnological processes (e.g. flagellar, heat or acid stress proteins). This leads to non-efficient use of protein synthesis capacity (translation machinery) and energy for bioprocesses. Thus removing the expression burden of unnecessary proteins i.e. creation of lean-proteome strains, could enable to specifically manipulate the allocation of ribosomes for higher synthesis of proteins leading to increased target molecule production. One could theoretically greatly increase the key metrics of bioprocess performance (titer, yield, productivity) by deleting as few as ca 10 unnecessary genes with the highest translational burden in E. coli (in total 7% of proteome) and substituting the freed 7% of the total proteome with target molecule-related proteins. In LEANPROT we will demonstrate the potential of this concept as proof-of-principle by creating superior E. coli strains of recombinant protein production through reducing the expression of unnecessary proteins. LEANPROT will yield E. coli strains with superior performance of recombinant protein production - theoretically at least 50% higher productivity and titer - as a result of proteome optimization. Since targeted optimization of the layer of protein synthesis capacity should be applicable to a broad range of organisms, from bacteria to yeasts to higher eukaryotes, LEANPROT has potentially a big impact in the advancement of cell design overall.