Unravelling the secrets of oxidative biomass decomposition

Enzymatisk depolymerisering av robuste polysakkarider som kitin og cellulose er viktig i det globale karbonkretsløpet og av stor vitenskapelig og kommersiell interesse. Bedre forståelse av naturens verktøy for å bryte ned cellulose og kitin, slik som vi finner i plantecellevegger, trevirke, insekter og rekeskall, vil påvirke viktige områder innen biologisk forskning, for eksempel rundt mikrobiell adferd og virulens, og rundt plantepatologi. Videre er effektiv nedbrytning av ikke-spiselig biomasse, slik som halm og tre, et viktig skritt i såkalt annen generasjons "bioraffinering", hvor disse materialene omdannes til nyttige produkter. I 2010 oppdaget vi en helt ny type enzymer som heter Lytisk Polysakkarid Monooxygenaser (LPMOer) og dette har hatt en stor innvirkning innen både forskning og industri. I motsetning til det man trodde tidligere, er det nå klart at oksidative enzymatiske prosesser katalysert blant annet av LPMOer er viktige i naturens nedbryting av biomasse. Dette åpner nye perspektiver, både i grunnleggende vitenskap og i industrielle applikasjoner. Vi trenger å vite mer om LPMOer, spesielt siden noen organismer kan ha så mange som 30 LPMO gener, som viser at disse enzymene virkelig er viktige. I dette prosjektet utfører vi grunnleggende studier av LPMOer med sikte på å svare på følgende spørsmål: (1) Hva er de strukturelle egenskapene som bestemmer substrat spesifisitet og katalytisk effektivitet? (2) Hva er de hastighetsbegrensende faktorene for LPMO aktivitet in vitro og in vivo? (3) Hvordan bidrar LPMOene til mikrobers evne til å bryte ned biomasse? (4) Hva er samspillet mellom LPMOer og andre redoks enzymer som er involvert i nedbryting av biomasse? (5) Hva er den molekylære mekanismen bak LPMOenes enorme katalytiske kraft? Dette grunnleggende prosjektet, med både ambisjoner og potensialet til å levere banebrytende forskning, blir samkjørt med et Marie Curie trening nettverk (avsluttet i 2021) og med anvendte prosjekter innen bioraffinering. I 2020 fikk prosjektlederen et ERC Synergy prosjekt og også her er det samkjøring samt at vi bygger videre på det vi har oppnådd så langt. Synergy prosjektet har fokus på de mest grunnleggende spørsmålene, men også, og ikke minst, på et stort anvendt mål, nemlig å få disse unike enzymene til å katalysere andre typer reaksjoner som er nyttige. Høydepunkter fra prosjektets siste fase inkluderer: - PhD stipendiaten forsvarte sin avhandling 23. juni 2022. - En artikkel i PNAS og en i Nature Communications som viser hvordan sollys kan brukes til å drive LPMO reaksjoner. Funnene som beskrives her kan gi en delvis forklaring for hvorfor lys påvirker det som skjer med plantebiomasse i naturen (økt lys -> økt nedbryting) og gir også muligheter for å bruke mindre energi (nemlig lys istedenfor kjemisk energi) når man skal bryte ned biomasse med enzymer. - Vi har jobbet videre med vår tidligere oppdagelse av LPMOer som virker spesifikk på xylan (en såkalt «hemicellullose»). Dette kan gi ny forståelse av hvordan LPMOer kan gjøre mye mer enn bare å bryte ned cellulose og kitin. Det kan hende at det store arsenalet av LPMOer er til for at organismer skal klare å bryte ned forskjellige deler av den svært komplekse plantecelleveggen. - Vi har kommet i gang med en enda bredere tilnærming til spørsmålet om hvilke naturlige substrater som LPMOer kan virke på, deriblant bakterielle og fungale cellevegger. Det er nå klart at det å finne ut mer om dette kan gi helt nye biologiske innsikter og bioteknologiske applikasjoner. Dette arbeidet skal videreføres i et NMBU-finansiert nytt PhD-prosjekt. - Vi har også utført unike mutagenese studier for å lage LPMOer med forbedrede og nye egenskaper. Her brukte vi en såkalt «directed evolution» tilnærming, som betyr at man lager et stort bibliotek med tusenvis av LPMO varianter for så å lete etter varianter med gunstige og interessante egenskaper. Det er svært vanskelig å gjøre slike forsøk med LPMOer og vi er de første i verden som har fått dette til. Denne tilnærmingen vil gi dypere forståelse av hvordan disse enzymer virker og vil samtidig kunne gi nye enzymvarianter som muligens kan anvendes i industrien. Dette arbeidet vil bli fullført i ERC prosjektet. Våre funn brukes også i andre, mer anvendte prosjekter ved NMBU, som i FMEen Bio4Fuels og i et internasjonalt ERA-Net prosjekt hvor LPMOer anvendes til å produsere bedre cellulose-fibere. I 2022 fikk vi et nytt EU prosjekt på bioraffinering av kitinrik biomasse hvor LPMOer anvendes. Til slutt kan det nevnes at dette prosjektet også har hjulpet til danne grunnlaget for et helt nytt prosjekt ved NMBU, Enzyclic, hvor vi blant annet skal prøve å engineere LPMOer til å bryte ned plast.

Prosjektet har sterkt bidratt til at NMBUs verdensledende fagmiljø i feltet har behold og videreutviklet sin posisjon. Miljøet er respektert verden over og har blant annet produsert både originalpublikasjoner i toppjournaler og ledende oversiktsartikler, som siteres mye, noe som bidrar til å sette NMBU, og dermed Norge på kartet. NMBU er en ettertraktet samarbeidspartner for internasjonal akademia og industri. Prosjektet har ført til, eller muliggjort, flere typer (delvis ad hoc) internasjonalt samarbeid, som bidrar til (1) å få flere, bedre og mer relevante resultater, (2) å styrke forskningspartnernes og Norges renomme i feltet, og (3) å styrke grunnlaget for framtidig samarbeid. Når det gjelder publikasjoner har prosjektet vært enormt produktivt. Prosjektet har generert kunnskap som har blitt brukt av industrien (Borregaard, No og St1, Fi) i andre, prosjekter med et anvendt fokus. Borregaard har utviklet teknologi basert på NMBU kunnskap som har blitt verifisert i pilot (flere tusen liter) skala. Prosjektet har vært med på å danne grunnlaget for SFI Industriell Bioteknologi (2020-2028), hvor mange norske industrier er med. Grunnforskningsprosjekter som dette er av avgjørende betydning for at vår mer anvendte forskning har tilstrekkelig høyt nivå og kan bidra til å skape virkelige konkurransefordeler. Prosjektet har bidratt til at vi kan være en pålitelig og ikke minst uavhengig kunnskapsleverandør til norsk industri og andre interessenter. Prosjektet har gjort det mulig å bidra litt til forskning på LPMOenes rolle i patogene mikroorganismer. Dette er et svært viktig tema, siden LPMOer tilsynelatende spiller nøkkelroller i flere humane sykdommer og plantesykdommer, mens de til og med kan spille en rolle i overlevelse av lakselus i sjøvann. Det jobbes med å bygge videre på dette og NMBU har allerede valgt å bruke noen av sine egne ressurser til å utvikle dette feltet. Prosjektet har vært en vesentlig del av grunnlaget for tildeling av ERC-Synergy prosjektet «Cube» (Unravelling the secrets of Cu-based catalysts for C-H activation; 2020-2026), hvor Eijsink (NMBU) er av fire PI (de andre PI er fra UiO, Italia og Tyskland). Her er målet å bruke all den akkumulerte LPMO-kunnskapen til få LPMOer til å katalysere helt nye type «vanskelige» reaksjoner, med potensielt vesentlige bidrag til et mer bærekraftig samfunn. En annen follow-up er det nye Enzyclic prosjektet (ledet av Gustav Vaaje-Kolstad; NFR) hvor vi blant annet skal videreutvikle noen av de LPMOene som vi har studert i prosjektet for bruk i enzymatisk resirkulering av plast. En siste follow-up er et EU finansiert prosjekt på bioraffinering av kitin-rik biomasse, som heter Valuable (2022-2025).

Enzymatic depolymerization of recalcitrant polysaccharides such as chitin and cellulose is a crucial element of the global carbon cycle and of great scientific and commercial interest. A better understanding of Nature's tools for degrading cellulose- or chitin-rich co-polymeric structures, as in plant cell walls and insect cuticles, will have a profound impact on areas such as microbial physiology, plant pathology and biorefining. The 2010 discovery of Lytic Polysaccharide Monooxygenases (LPMOs), in our lab, has changed the classical paradigm of polysaccharide turnover being accomplished by hydrolytic enzymes only. It is now clear that LPMO-catalyzed oxidative processes play a major role. Accumulating experimental data, as well as the abundance of LPMO-encoding genes in biomass-degrading microorganisms, indicate that the action of these copper-enzymes is very important and, moreover, that novel functionalities are yet to be discovered. Today, we know that LPMO function is affected by reductants, molecular oxygen, bivalent metals, redox mediators and even light, but the implications of these features for LPMO function in natural biomass conversion remain largely unexplored. In this project, we will carry out fundamental studies of LPMO functionality, primarily aimed at answering the following outstanding questions: (1) What are the structural determinants of substrate specificity and catalytic efficiency? (2) What are the rate-limiting factors determining LPMO activity in vitro and in vivo? (3) How does microbial biomass conversion depend on LPMO action? (4) What is the interplay between LPMOs and other redox enzymes, e.g. enzymes acting on other polymers in natural substrates, such as lignin in plant cell walls? (5) How exactly do LPMOs act on their natural substrates? This fundamental project, with the ambition and potential to deliver ground-breaking research, will be aligned with a Marie Curie training network and with applied projects in biorefining.