ERA-NET: Thermostable isomerase processes for biotechnology

Disulfid-isomeraser er essensielle enzymer involvert i dirigering av korrekt oksidativ folding av et stort antall proteiner, særlig de som utskilles til det ekstracellulære miljøet. De utfører denne aktiviteten ved å rearrangere disulfidbroer, en spesiell type kovalente bindinger mellom sidekjedene hos ulike cystein-residuer i polypeptidkjeder og derved hjelper disse proteinene(substratene) til å folde seg til sin korrekte tredimensjonal konformasjon. Denne aktiviteten er kjent som oksidativ folding og er svært viktig for normal funksjon av alle celler. I TIPs prosjektet har vi som målsetting å identifisere og karakterisere nye termostabile disulfidisomeraser med potensial for anvendelse i produksjon av andre industrirelevante enzymer enten under produksjonen av enzymer eller for å øke enzymenes holdbarhet. I en tidligere fase identifiserte vi noen termostabile disulfid-isomerase enzym-kandidater i genomer fra termofile mikroorganismer og i metagenomer fra varme (ekstreme) miljø. Produksjon av disse enzymkandidatene i en heterolog vert (E. coli) ble optimalisert og deres katalytiske aktivitet delvis karakterisert. Noen av de mest lovende kandidatene ble valgt ut for videre funksjonelle og strukturelle undersøkelser. I samarbeid med Centre for Biocatalysis ved University of Exeter i England, har vi optimalisert en oppskalering av enzym-produksjonen, samt renseprotokoll og krystalliseringsbetingelsene for fire ulike kandidater. Flere proteinkrystaller har blitt dannet og analysert vha. røntgendiffraksjon. Selv om krystaller diffrakterte var oppløsningen svært dårlig, og vi fikk derfor ikke gode nok data til å lage krystallstrukturer selv om det ble gjort forsøk på optimalisering av krystalliseringsbetingelsene, og seeding-teknikker ble prøvd. Parallelt med dette har det også blitt arbeidet med syntetisk biologi metoder for å utvikle en rask høy-gjennomstrømmings (high throughput) plattform for aktivitets-basert screening av disulfid isomeraser. Et skreddersydd fosfatase-enzym brukes i dette oppsettet som et mål-substrat for å screene for disulfid-isomeraser vha. en in vivo komplementerings assay. Dannelse av korrekte disulfidbroer dirigert av kandidat-enzymene resulterer i en funksjonell fosfatase som reagerer i en kolorimetrisk reaksjon. Denne plattformen gjør funksjonell identifikasjon av nye disulfidisomeraser enklere og raskere. Totalt ble 12 gener for enzymkandidater med opprinnelse fra termofile bakterier som lever ved ulike temperaturer (fra 50oC til over 80oC) valgt ut, klonet og uttrykt i E. coli. De rekombinante enzymene ga ulik grad av ekspresjon og løselighet. Enzymaktivitetsmålinger viste også en varierende grad av biokjemisk aktivitet. En av enzymene (kandidat C011), fra en Geothermobacter sp. hadde optimal temperatur mellom 70 og 80oC, og høyest aktivitet av alle de uttrykte enzymene. Fire kandidater, inkludert C011 ble forsøkt krystallisert, men bare en av disse (kandidat C008) ga krystaller etter å ha prøvd 400 ulike krystalliseringsbetingelser i en krystalliseringsrobot i Exeter. Kvaliteten på røntgendiffraksjonen var imidlertid så dårlig at strukturoppløsningen bare var max. 12Å, som er for dårlig til å kunne lage strukturmodeller. Prosjektet oppnådde ikke sine målsettinger, spesielt når det gjelder strukturbiologi-målene, men et utvalg disulfid-isomeraser fra termofile bakterier som vokser ved ulike temperaturer har blitt uttrykt i E. coli, renset, og biokjemisk karakterisert, og disse kan tjene som et verdifullt utgangsgpunkt for videre analyser eller anvendelser.

The outcomes of this project are increased preliminary knowledge of the properties of protein disulfide isomerases from a variety of thermophilic bacteria thriving at a range of different temperatures and their behaviour following heterologous expression in E. coli. Structural analyses of selected disulfide isomerases are still ongoing and will potentially yield important 3-dimensional information. In the future this basic information can improve the use of disulfide-correcting enzymes in biotechnological processes for heterologous expression and correct folding, in particular of thermophilic proteins that tend to form aggregates due to incorrectly formed disulfide bonds.

The TIPs project focuses on the provision of novel thermostable isomerases from thermophilic microorganisms and metagenomes and their biotechnological applications. Isomers are molecules with identical atomic composition but with different structural characteristics. Different isomers can show very distinctive function. The formation of isomers often reduces the productivity of biotechnological and Chemical processes because only one of the two or more isomers is utilized in biocatalytic reactions (reducing the final efficiency to below 50%). Isomerases are enzymes catalyzing the conversion between different types of isomers. Using the appropriate isomerase enzyme in the industrial process will increase production efficiency resulting in 100% conversion of a racemic substrate to the product. Thermostable isomerases are desired because they possess high resistance and durability, are able to withstand harsh industrial process conditions,including heating and organic solvents. Elevated temperatures can also enhance substrate accessibility and solubility. The proposed project includes comparative bioinformatic analyses of sequence data to identify different classes of thermostable isomerases of industrial interest which will be cloned, over-expressed, functionally and structurally characterized and optimized towards their biotechnological application. Three types of isomerases will be targeted: sugar isomerases (to produce new desirable sugars for calorie-free sweeteners and as building blocks for drugs), disulfide isomerases (to improve protein folding and stability of industrial enzymes), and chalcone isomerases (involved in the transformation of flavonoids, secondary metabolites of importance as natural colorants, anti-oxidants, anti-microbial and anti-inflammatory agents). Durable isomerases will allow new opportunities for green, competitive and sustainable biotechnological processes that can replace conventional chemical synthesis.