ERA-NET: STREPTOMYCES-BASED CELL FACTORIES FOR THE PRODUCTION OF TACROLOGUES DRUGS

Tacrolimus er et farmasøytisk produkt som undertrykker kroppens immunrespons og derved forhindrer at kroppen avstøter transplanterte organer. Tacrolimus produseres industrielt i en fermenteringsprosess basert på en bakterie i Streptomyces-slekten. Målet med TacroDrugs-prosjektet er å utvikle varianter av tacrolimus med andre biologiske effekter enn orginalmolekylet. TacroDrugs har partnere fra Tyskland, Spania og Portugal, foruten SINTEF i Norge. Våre partneres oppgave er å "omprogrammere" den tacrolimus-produserende bakteriestammen slik at den istedenfor tacrolimus, produserer nye, beslektede, men kjemisk litt endrede versjoner av tacrolimus, såkalte tacrolimus-derivater. SINTEFs oppgaver er (1) å identifisere overproduserende stammer konstruert av våre partnere, 2) identifisere, produsere og rense opp nye tacrolimusderivater som produseres av stammer konstruert av våre partnere og 3) å øke utbyttet av tacrolimus ved å optimalisere fermenteringsprosessen. Den kunnskapen vi får om hva som påvirker produksjonen er også relevant for andre fermenteringsprosesser der man bruker Streptomyceter for medikamentproduksjon. Prosjektet er nå avsluttet etter 3,5 år. Våre partnere har fokusert på å forbedre produksjons-stammen ved å redusere biosyntetiske flaskehalser, fjerne genklustere som ikke har noe med tacrolimus å gjøre, fjerne genene som koder for tacrolimus og finne gunstige steder i genomet for å sette inn nye, muterte varianter av tacrolimusgenene. Alle kandidatene som er laget hos samarbeidspartnerne våre er testet i kontrollerte fermenteringer ved SINTEF. En partner har lyktes, ved hjelp av CRISPR teknologi, å endre på tacrolimusgenene slik at det produseres en tacrolimusvariant. Denne har blitt produsert og renset hos SINTEF evaluert farmakologisk hos en av våre partnere. For å kunne forbedre produksjonsprosessen og vurdere nye produksjonsstammer på en effektiv måte, har SINTEF etablert metoder for miniatyrisert dyrkingsprosess (1,2 ml kulturvolum), en såkalt mikrofermentering. En slik mikrofermentor kan utføre sanntidsmålinger av viktige fermenteringsparametere samt utføre automatisk tilsatser og prøvetaking. Softwaren til mikrofermentoren er blitt betydelig forbedret i løpet av det siste året basert på SINTEFs behov og tilbakemeldinger i TacroDrugs prosjektet. Gjennom >380 mikrofermenteringer og 74 1-L/3-L fermenteringer har vi klart å evaluere alle mutantene vi har fått fra våre samarbeidspartnere. For villypen har vi etablert en ny fermenteringsprosess i fermentor som gav 4 ganger høyere volumetrisk utbytte av tacrolimus enn startbetingelsene vi benyttet i prosjektet. Ytterligere forbedring i produksjon er oppnått ved bruk av mutanter etablert av partnerne i konsortiet. Beste stamme gav dobling av volumetrisk produksjonsutbytte sammenlignet med villtype. Effektive, raske analysemetoder for tacrolimus og dens derivater er også utviklet av SINTEF. Med en analysetid på bare ti minutter per prøve, kan vi evaluere produksjonsegenskapene til et stort antall mutanter og fermenteringsbetingelser. En metode for å identifisere nye derivater av tacrolimus er også utviklet. Vi har også utviklet metoder for rensing av tacrolimusderivater fra fermenteringene vi har utført.

TACRODRUGS har bidratt til å konstruere en universell vert for produksjon av biofarmasøytika. En slik vert kan også benyttes for produksjon av andre biomolekyler enn tacrolimus. Det er videre implementert teknologi, blant annet CrispR-Cas, for å endre på geninformasjon slik at nye biomolekyler med nye egenskaper blir produsert. Det er mange som jobber innen dette feltet, og kunnskapen som er etablert i prosjektet vil derfor være av interesse for mange ulike forskningsmiljøer. I TACRODRUGS har vi studert effekten av en rekke globale regulatorer, og det ble funnet regulatorer som viste positiv effekt på produksjon av tacrolimus. Det er sannsynlig at disse regulatorene også kan øke produksjonen av andre forbindelser produsert av Streptomyceter. Gjennom prosjektet har det blitt generert mye kunnskap om hva som påvirker og ikke påvirker produksjon av tacrolimus. Tacrolimus er en kommersielt viktig forbindelse, og denne kunnskapen vil derfor ha nytteverdi også utenfor prosjektet.

In the last decade significant efforts have been made in the development of a universal hosts for the expression of natural products derived from bacterial specialized metabolism. This approach has originated promising results regarding the identification of novel bioactive compounds. However, the production yields are low unveiling a deficient metabolic flux background and undermining this strategy for downstream industrial applications that rely on high production yields. TACRODRUGS introduces the concept of a specialized expression host that combines the stability features of the universal expression host with the metabolic fitness for producing high added-value products. The main goal of TACRODRUGS is to develop a sustainable and robust microbial industrial platform for the production of new tacrolimus and non-immunosuppressive tacrolimus analogues (tacrologues) through the synergic use of synthetic biology principles and metabolic engineering methodologies, guided by global metabolic network understanding.