Innovative Nanopharmaceuticals: Targeting Breast Cancer Stem Cells by Novel Combination of Epigenetic and Anticancer Drugs with Gene Therapy

En utfordring i behandling av brystkreftpasienter er høy tilbakefallsfrekvens. Dette prosjektet har hatt fokus på sirkulerende kreftstamceller, som er en viktig årsak til tilbakefall hos pasientene. Målet med prosjektet var å utvikle ny medisin for behandling av brystkreft ved hjelp av målrettet terapi ved bruk av nanopartikler. Behandlingen baserer seg på kjemoterapi i kombinasjon med epigenetikk, genterapi og radioterapi. Tanken er å kombinere alle disse aspektene i et nytt farmaka - COMBOBOMB - basert på nanomedisin. Safe-by-design prinsippet er gjeldende for hele prosjektet, der toksisitetstesting blir utført parallelt med utviklingen av medisinen og ulike modifikasjoner av liposomene har blitt gjort deretter. Dette gjøres for å bidra til at sluttproduktet er effektivt uten å ha alvorlige bieffekter. Toksisitetstestingen gjøres av de norske partnerne i nært samarbeid med de prosjektpartnerne som utvikler nanopartiklene. Standardprosedyrer (SOPer) har blitt utviklet for dyrkning av de 4 utvalgte brystkreftcellelinjene, T47D, JIMT-1, MDA-MB-231 og MCF10A, og for å undersøke induksjon av celledød og DNA skade (cyto- og gentoksisitetstester) av nanomaterialene. En vanlig utfordring innen nanotoksikologi, er interferens mellom testmetoden og nanomaterialet som skal testes. Derfor er det er viktig å benytte testmetoder som er validert for testing av nanomaterialer. For testing av celledød (cytotoksisitet), er det utarbeidet SOPer for ulike testmetoder: To såkalte kolorimetriske metoder der cellene farges med fargestoff (Tryfan blå og Alamar blå (AB)) og to fargefrie metoder der celledød måles med såkalt elektrisk impedans eller kolonidannelse (colony forming efficiency (CFE)). Tradisjonelle toksisitetstester i laboratoriet utføres under statiske forhold, og reflekterer således ikke det virkelige liv. UiB har derfor utarbeidet et innovativt oppsett med mikrovæskestrøm som skal etterlikne eksponering av brystkreftceller i kroppen. Flere avanserte 3D in vitro modeller (multiaggregater og sfæroider) for de ulike brystkreftcelletypene, som bedre etterlikner in vivo situasjonen i kroppen, er etablert. UiB har bygget en multikompartment chip med mikrovæskestrøm for bedre vekst av brystkreftceller, tumorassoriserte stromale celler og mikroårer. For gentoksisitetstesting ble det benyttet en modifisert versjon av comet assay for å undersøke DNA trådbrudd og spesifikke oksidative DNA baseskader. NILU har modifisert og validert comet assay, samt AB og CFE, for testing av mange prøver samtidig (såkalt high-throughput-målinger) og testet egnethet for bruk til toksisitetstesting av nanomaterialer. UiB og NILU har etablert testsystemene, og har testet tilsendte referanse-nanomaterialer av gull (Au) i de aktuelle cellemodellene for validering av testsystemene til bruk for testing av nanopartikler. UiB har gjort toksisitetstesting med cellesubstrat og elektrisk impedans i sann tid med de 4 ulike brystcellelinjene med 3 ulike liposomale nanobærere som er produsert av vår partner, og også av løselig doxorubicin. Kombinasjonsbehandling med doxorubicin pakket i liposomer og spesialutviklede liposomer er testet i de 4 ulike monokulturmodellene og i 2 ulike 3D mammosfærer og 3 ulike 3D multiaggregat modeller. Endepunkter som ble målt var celledød og genotoksisitet. Toksisitet av nanomaterialer avhenger av fysiske og kjemiske egenskaper, som for eksempel størrelse. Det er derfor viktig å analysere størrelse og størrelsesfordeling av nanomaterialet i den løsningen som skal brukes for toksisitetstesting. Størrelse, størrelsesfordeling og stabilitet av nanopartikler i både stamløsning og i cellekulturmediet har blitt målt ved bruk av nanopartikkel tracking analyse og dynamisk lysspredning (DLS). De fleste liposombærerne var stabile i løsning, unntatt Au. Denne ustabiliteten ble funnet å skyldes oksidering, og derfor ble nye batcher delt opp i flere rør og forseglet i argon eller nitrogen atmosfære. Det har vært noen utfordringer knyttet til design av nanopartikler som selektivt tas opp i brystkreftceller, og ikke i normale brystceller. UiB har gjort opptaksanalyser i 3D kulturmodellene av ulike liposomformuleringer (nanobærere) for å finne den mest lovende kandidaten for selektivt opptak i kreftceller og dermed målrettet behandling. Den beste nanopartikkel-kandidaten ble valgt ut for videre behandling, og overflaten modifisert for å øke det selektive opptaket i brystkreft stamcellene. Cytotoksisitet av nanobærerne ble testet, og det ble med real-time elektriske impedansmålinger vist at liposomene ikke induserte toksisitet, og nanobæreren var ikke gentoksisk. I konklusjon, så peker våre data mot et potensial for lavdose behandling med decitabine (DAC) for å sensitivere trastuzumab-resistente HER2-positive brystkreftceller for konvensjonell kjemoterapi, og at dette gir ny mulige behandling med mindre bivirkninger for brystkreftpasienter med begrensede behandlingsmuligheter.

The aim of this project was creation of multifunctional nanosized particles containing drugs (DOX, DAC) to kill tumour cells, together with targeting compounds (chitosan). Our data point to the potency of low-dose decitabine to sensitize trastuzumab-resistant HER2-positive breast cell tumors to conventional chemotherapy and might provide new treatment modalities with reduced side effects. Further, partners have shared their knowledge, biological models, innovative technologies, data, and specific know-how, and have also jointly trained young scientists and PhD students, as well as trained young scientists in project management. We have provided important data in the fields of nanomedicine, nanotoxicology, safe-by-design, advanced in vitro models and methods, and new strategies for breast cancer treatment. Many scientific papers have been published, and two joint papers are in preparation, and data has been disseminated extensively by oral presentations.

The next generation of nanopharmacuticals combine a series of advances which enable the creation of multifunctional nanodrugs that may contain anti-tumour agents, targeting ligands designed to home in on malignancies together with imaging agents to light up even the earliest stage of cancers. The nanotechnology in combination with conventional chemotherapy, gene therapy and epigenetics opens the door to novel therapeutical approaches. The aim of this project is to develop innovative multifunctional nanopharmaceuticals to overcome the low efficacy and frequent relapses in breast cancer (BC) treatment, with emphasis on cancer stem cells (CSCs). The multimodal COMBOBOMB, brilliantly integrates the diagnostic and therapeutic functions within a single nanostructure. The COMBOBOMB harbours four major components: 1) a selective targeting moiety, 2) a diagnostic imaging aid for localization of the malignant tumour and its micro- or macrometastases, 3) a cytotoxic drug (doxorubicin) and 4) a chemosensitising agent (decitabine) utilising gene therapy and epigenetic approaches. The inorganic nanocrystals entrapped in the nanocarrier will allow real time non-invasive imaging of the COMBOBOMB biodistribution and accumulation at the tumour site, and will allow the monitoring of patients` response to treatment. This multifunctional nanodrug will offer new possibilities of penetration into CSC niches and open new horizons for treatment of tumour cells in bulk and CSCs. The COMBOBOMB has the potential to be used also as neoadjuvant therapy, to decrease the probability of tumour cell dissemination (mainly via the CSC subpopulation). COMBOBOMB could increase radiotherapy efficacy by ehancing radiosensitization of tumour tissue, and represents a new generation of nanomedicine with enhanced potential for both therapeutic treatment and decreased recurrence of BC,with potentially high impact on survival and quality of life of BC patients, as well as economical impact for society.