Bridging biological and soft matter technologies to reveal the molecular mechanism of a bacterial colonization factor

Strukturbiologi har i nyere tid levert noen av de viktigste gjennombruddene i biologi. Feltet ble drevet frem av røntgenkrystallografi og teknologiske gjennombrudd i produksjon av røntgenstråling fra synkrotroner. Proteiner som består av cirka 50% hydrogenatomer forblir usynlige for røntgenkrystallografen. Dette er problematisk da hydrogenatomer spiller en svært viktig rolle i proteiners struktur og funksjon. Nøytronstråling gir oss mulighet for å se disse lette og svært viktige allestedsnærværende atomene. I tillegg skades proteiner nesten ikke av nøytronstråling, i motsetning til røntgenstråling. Dermed kan eksperimentene foretas under forhold som likner på de naturlige betingelser til proteinene. Spallasjonsteknologi kan gi oss nøytronstråling av høyere intensitet enn noensinne før, og den mest avanserte kilden, European Spallation Source (ESS), er under konstruksjon i vårt naboland Sverige. Dette prosjekt har siktet på å anvende nøytronbaserte teknikker for å komplementere klassiske strukturbiologiske metoder i studiet av en viktig virulensfaktor som finnes i bakterier av vibriofamilien. I tillegg finnes det liknende proteiner i mange andre bakterier, og til og med i virer. Teknikkene inkluderer nøytronkrystallografi, en komplementær teknikk til røntgenkrystallografi som kan visualisere hydrogenatomene i proteinet og dermed gi ytterligere innsikt i deres funksjon på atomært nivå. Med nøytronreflektometri og SANS kan interaksjonen av proteinet med dets naturlige krystallinske substrat kitin bli analysert. Eksperimenter er blitt utført for alle tre av disse teknikkene. Hovedfokuset har vært på anvendelsen av nøytron- og røntgenstrålingsteknikker (SANS/SAXS) for å karakterisere strukturene i løsningen. Vi har utviklet en effektiv protokoll for proteindeuterering, og bestemt D2O-kontrastpunktet for proteinets interaksjonspartner kitin ved hjelp av kontrastmodulering, i samarbeid med forskere ved Institut Laue-Langevin i Grenoble. Vi fant videre at adhesinet binder kitin nesten som perler på en snor, men ikke like regelbundet. Noen av disse målingene har blitt utført i USA, på National Institute of Standards and Technology (NIST). Resultatene våre tyder på hvordan binding av adhesinet forbereder dannelse av mikrokolonier av bakterier på overflaten av kitin, som er svært utbredt i marine omgivelser. Videre har vi studert hvordan ioner påvirker adhesinstrukturet og dens binding til kitin. Neste steg er nøytronkrystallstrukturen til det deutererte proteinet. Vi har allerede fått lovende krystaller som diffrakterer røntgenstråler til atomær oppløsning. Nå gjenstår det å få større krystaller. I tillegg til virulensfaktoren fra vibriobakterier har vi studert struktur og funksjonen til et nært beslektet protein fra Pseudomomas aeruginosa, som hyppig utvikler antibiotikaresistens. Prosjektet er svært interdisiplinært med mange metoder integrert for å nå målet: å gi et komplett bilde av adhesinets struktur og funksjon. Prosjektet har gitt oss viktig kunnskap av stor verdi for legemiddelvitenskapen. Den kan bidra til å bekjempe antibiotikaresistens, og er også relevant for lakseoppdrett og produksjon av fornybar bio-brennstoff - og forbereder oss på eksperimenter på verdens beste neutronkilde, ESS.

The two main effects of this project are: (1) It has increased our competence in neutron-based structural biology technologies that will prepare us and the users of our core facilities (NORCRYST) for exciting experiments at the world's brightest neutron source, the ESS. (2) The obtained insights into the structure and function of two bacterial virulence factors open new doors to combat antibiotic resistance.

Currently, neutron based technologies are applied mainly in soft matter and materials science, whereas their application to biological matter is limited. This proposal aims at establishing a platform of competence within neutron based methodologies relevant to the Life Sciences that will prepare us for applications at the European Spallation Source (ESS). Essential technologies of this neutron-based toolbox are neutron crystallography, neutron reflectometry and small-angle neutron scattering. Common to all these techniques is the requirement for protein deuteration. The development, establishment and consolidation of relevant know-how will be of significant value to the structure biological community in Oslo and the rest of Norway. The long term goal is to append neutron based scattering techniques to the synchrotron pipeline of structural biology today, complementing and enhancing future molecular models. As target, we selected the secreted colonization factor GbpA from Vibrio cholerae. This protein serves as adhesin to aquatic biofilms and human mucins, and enzymatically degrades chitin (and maybe other targets?) with its LPMO domain. As such, GbpA promises important insights into biofilm formation and clearance affecting fish and man, as well as exploitable results related to biofuels and hence bioeconomy. In this work, we will use cutting-edge technologies in collaboration with international partners, and will provide internationally competitive career development training to our young recruit.