Phenotypic diversification in denitrification: mechanisms, prevalence and implications

Mikrobene hersker over planeten vår og de koloniserer alle tenkelige habitater. Deres allestedsnærværelse skyldes et imponerende utvalg av livsstiler og deres store antall gjør dem til viktige drivere for jordens biogeokjemiske sykluser, for eksempel karbon- og nitrogen-syklusen. Hvis et stoff kan spises eller pustes (respireres), vil det være mikrober (dvs. bakterier, archaea, sopp) som spesialiserer seg på nettopp det. Som alle andre levende organismer, behøver bakterier grunnstoffer som karbon og nitrogen for å bygge makromolekyler (f.eks. DNA og proteiner), og de trenger energi for å drive sin metabolisme. Respirasjon er en svært effektiv strategi for å høste energi. Mens dyr som oss selv er begrenset til å puste oksygen (aerob respirasjon), kan mange bakterier bruke andre forbindelser i stedet (anaerob respirasjon). Denitrifikasjon, den trinnvise reduksjonen av nitrat (NO3-), via nitritt (NO2-), nitrogenoksid (NO) og dinitrogenoksid/lystgass (N2O) til nitrogengass (N2), er en type anaerob respirasjon som finnes i et bredt spekter av bakterier. Disse organismene foretrekker vanligvis aerob respirasjon, men vil bytte til denitrifikasjon når det er nødvendig. For å gjøre dette, må de fange opp at tilgangen på oksygen er knapp, uttrykke relevante gener og bygge utallige nye proteiner, inkludert fire kjerneenzymer, ett for hvert av reduksjonstrinnene. Det er i organismenes interesse å holde denne overgangen under streng kontroll fordi 1) aerob respirasjon er energetisk mer lønnsomt enn denitrifikasjon og 2) å bygge nye proteiner er kostbart. Hvis en celle reagerer for raskt, mens aerob respirasjon fremdeles er mulig, vil den kaste bort ressurser ved å bygge et unødvendig maskineri; om den er for sen, risikerer den å bli fanget i anoksi uten å kunne høste energi for liv og vekst. Bakterier har utviklet mange måter å regulere denitrifikasjon på, men et fellestrekk er at lavt oksygen og tilstedeværelsen av nitrat / nitritt / NO induserer genuttrykk. Inntil nylig har konsensus underforstått vært at i en populasjon av celler som tilhører samme art, vil alle uttrykke hele denitrifikasjonsapparatet når de står overfor anoksi. Vi har funnet ut at dette ikke stemmer. Innenfor prosjektet har vi vist at noen bakterier, som modellorganismen Paracoccus denitrificans, sprer innsatsen (bet-hedging). I stedet for å gå «all in» og uttrykke hele settet med denitrifikasjonsproteiner i alle celler, vil celler i samme populasjon differensiere. Alle celler vil produsere N2O-reduktase, og dermed redusere N2O til N2, men bare en brøkdel vil utføre hele firetrinnsprosessen. Derfor blir P. denitrificans et netto N2O-sluk i møte med anoksi. Videre har vi vist at P. denitrificans også sikrer seg når oksygen kommer tilbake. Den bevarer evnen til å denitrifisere i en underpopulasjon av ikke-voksende «persisterceller». Innenfor prosjektet har vi studert reguleringsmekanismene bak disse fenomenene, i tillegg til å undersøke forekomsten av bet-hedging blant denitrifiserende bakterier. Våre funn har implikasjoner for forståelsen av N2O utslipp fra naturlige systemer. Arbeidet i dette prosjektet har utstyrt oss med detaljert kunnskap om denitrifiserende bakteriers fysiologi. Dette har åpenbart nye bioteknologiske muligheter som vil bli utforsket videre innenfor det nylig oppstartede «AnaPro»-prosjektet (https://www.nmbu.no/prosjekter/node/43227), finansiert av Novo Nordisk Fonden.

The work within this project has equipped us with detailed knowledge of denitrifier physiology, particularly in terms of bet-hedging. This has implications for our understanding of soil N2O emissions, thus climate forcing, and it has unveiled further fundamental questions. But it has also pointed us towards new biotechnological opportunities, one example being the development of a new process (patent pending: #GB2100105.2) for high density culturing of denitrifying bacteria. The project leader has gained experience with project administration and with taking the lead in supervision of Phd students, reaching out to collaborators and planning new projects. These skills were important when applying for funding for the AnaPro project (https://www.nmbu.no/prosjekter/node/43227), at the Novo Nordic Foundation (NNF), where we will explore the imperatives and further develop high density cultivation by denitrification. With this, we have ventured into a more applied direction, with new collaborators within Europe (Technical University, Delft and Vrije University, Amsterdam). We have also strengthened local connections and are collaborating with colleagues at NMBU for greater bandwidth (cross disciplinarity). This is important within the Anapro project, but also as we continue our basic research on the regulatory biology and physiology of denitrifiers, which requires advanced skills within microbiology, biochemistry and chemistry. The university (NMBU) routinely awards YRT grant holders with an extra PhD scholarship, which was also the case here. Thus, the project has spurred the production of two PhD theses: The RCN-financed candidate is expected to defend in late 2022, whereas the NMBU financed candidate will defend in 2024. The career of the project leader has evolved considerably during-, and due to the project: From being a researcher within a group, with limited responsibilities, to becoming part of the leader group and building her own team. Moreover, the NRC YRT project not only facilitated the NNF grant, but the career development over recent years played an integral part when the project leader recently secured a permanent position as Associate Professor at NMBU.

The aim of Dephend is to understand phenotypic diversification (PD) in the regulation of anoxic respiration in denitrifying prokaryotes, and explore the implications for their contribution to the emission of gaseous nitrogen oxides to the atmosphere. The point of departure is our discovery of PD in the model organism Paracoccus denitrificans, and circumstantial evidence for similar regulatory traits among other denitrifying bacteria. This opens a new avenue for research on the regulatory biology of denitrification. The project will improve our understanding of the mechanisms involved, assess how widespread such regulatory traits are among denitrifying prokaryotes, and clarify the implications for the emissions of NO, N2O and HONO in the field. In short, the PD phenomena involve early expression of N2O reductase in all cells, while only a fraction of the cells express nitrite reductase (NirS), ascribed to stochastic initial transcription of the gene, but with a positive feedback via NO. Dephend will further explore this NO signaling; if different NO-responsive factors or post-transcriptional phenomena are involved; and the possible fitness value of cell diversification. The project will combine molecular manipulations, refined physiological experiments and mathematical modelling. P. denitrificans expressing NirS with an mCherry fusion tag will be used as a model. Moreover, the prevalence and diversity of PD phenomena will be explored in a range of other soil bacteria. Dephend will be conducted in a setting where findings can rapidly be taken into a more applied context. This includes the exploration of strategies to mitigate annually increasing N2O emissions resulting from modern agricultural practice. Thus, the scope of Dephend encompasses basic knowledge generation relevant across disciplines in microbiology, and increased understanding of the processes driving the emission of N-oxides which affect atmospheric chemistry and contribute to climate forcing.