How to build a glass house: Revealing fundamental components of diatom cell wall biomineralization

Biomineralisering er levende organismers dannelse av komplekse uorganiske strukturer, og er en vidt utbredt prosess i naturen. En av de mest spektakulære eksemplene på biomineralisering finner man hos kiselalger, som er en gruppe av encellete alger med stor økologisk betydning. Celleveggen til kiselalger er bygget av silika (silisiumoksid), og danner en tredimensjonal struktur med komplekse, artsspesifikke poremønstre helt ned til nanometer-skala. Denne strukturen produseres inne i cellen, i et samspill mellom silika, organiske forbindelser og proteiner. Prosessen skjer i spesielle blærer kalt silika-deponeringsvesikler (SDV). Vi har identifisert en proteinfamilie som kun finnes hos kiselalger. Medlemmer av denne proteinfamilien, kalt Silicaniner, krysser trolig cellemembraner, og inneholder et domene uten kjent funksjon. Tidligere studier indikerer at et medlem av Silicanin-familien er lokalisert til SDV og at den har en rolle i celleveggdannelse. I dette prosjektet har vi studert en undergruppe av Silicanin-familien og deres mulige roller i biomineralisering av celleveggen hos kiselalger. For å gjennomføre funksjonelle studier av relevante gener er det nødvendig å etablere en effektiv metode for genetisk transformering av organismen. Da vi ikke var tilfredse med de eksisterende metodene for kiselalgen Thalassiosira pseudonana laget vi en protokoll for elektroporering, der genetisk materiale innføres i cella ved hjelp av en elektrisk puls. Vi forbedret også utrykket av seleksjonsmarkøren ved optimalisering av promoteren. Vi produserte flere mutanter for medlemmer av Silicanin-familien i to kiselalgearter ved hjelp av gen-redigering, og har startet karakterisering av disse i detalj. Vi utviklet en metode for tre-dimensjonal elektronmikroskopi av cellevegg hos kiselalger, noe som gi en mer helhetlig oversikt over endringer i mutanter. Vi har undersøkt den intracellulære lokaliseringen av flere medlemmer av Silicanin-famlien ved hjelp av mikroskopi. Vi forberedte også karakterisering av silicanin-bindende proteiner ved hjelp av såkalt "proximity proteomics". Videre har vi undersøkt to kinaser som vi tror er involvert i silikon-transport i noen kiselalger. Mutanter ble laget for kinasene, og vi startet karakterisering av endringer i proteinsammensetningen, noe som kan fortelle oss hvilke proteiner og prosesser som påvirkes av kinasene. Vårt mål er at resultater fra dette prosjektet vil løse noen av gåtene rundt dannelsen av celleveggen til kiselalger. I framtiden kan disse resultatene danne et grunnlag for spesial-design av silika-strukturer for spesielle formål innen bionanoteknologi.

I alt har åtte masterstudenter fullført sin masteroppgaver i tilknytning til prosjektet. PhD-studenten som har vært ansatt på prosjektet (Annika Messemer) planlegger å disputere i løpet av 2024. I tillegg har en PhD-student ansatt gjennom NTNU-midler (Marthe Hafskjold) arbeidet nært opp mot prosjektet, og har dratt fordeler av samarbeid. Hun forventes også å levere avhandlingen i løpet av 2024. I sammenheng med disse to PhD-avhandlingene forventer vi fire til seks publikasjoner. Manuskript vil trolig sendes inn for publikasjon i 2024 og 2025. Et bokkapittel vil bli publisert i mars 2024. Gjennom en av masteroppgavene tilknyttet prosjektet gjorde vi noen pilotforsøk med en annen kiselalge, Coscinodiscus wailesii. Dette arbeidet, sammen andre resultater direkte eller indirekte knyttet til prosjektet, førte til et samarbeid om prosjektsøknader med Martin Lopez-Garcia ved International Iberian Nanotechnology Laboratory i Portugal. I 2023 fikk vi innvilget midler fra Konvergerende Teknologier-programmet ved NFR for et fireårig prosjekt som skal studere muligheten for å manipulere kiselalger genetisk for å celleveggens egenskaper som en fotonisk krystall.

Biomineralization, the biological formation of complex inorganic structures, is a common process in nature. One of the most spectacular examples of biomineralization is the diatom cell wall (frustule), which is a three-dimensional silica structure with intricate, species-specific patterns ranging from nano- to micrometer scale. While a number of proteins have been identified that take part in the deposition and patterning of silica within a specialized compartment (the silica deposition vesicle, SDV), the process as a whole is poorly understood. There is extensive interaction between the SDV lumen and cytosolic factors such as the cytoskeleton, but the mechanisms of these interactions are unknown. We have identified a gene family restricted to diatoms encoding predicted transmembrane proteins with a yet uncharacterised domain. Several lines of evidence suggest that members of this protein family, termed Silica Matrix 7-Like (SMLs), are localized to the SDV membrane, and that they are involved in frustule biosynthesis. In this project, we aim to investigate the roles of the SML-D subfamily in cell wall biomineralization, using state-of-the-art molecular, biochemical and imaging techniques. Using CRISPR/Cas9-based genome editing, we will generate deletion series of the SML-D subfamily members. Silica production and frustule patterning, structure and chemical composition will be analysed in these mutants as well as overexpression lines. The intracellular localization and dynamics of SML-D members and their possible interaction with the cytoskeleton will be studied. Immunoprecipitation will be performed to identify possible interacting proteins. Finally, recombinant SML-D proteins will be analysed for direct or indirect effect on silica formation activity. The results from this project will increase knowledge on a fundamental process in the ecologically important diatoms, and could form the basis for a system to customize frustule structures for commercial applications.