PIRE: Advancing global strategies and understanding on the origin of ciguatera fish poisoning in tropical oceans: The Norwegian contribution

Ciguatera er navnet på en sykdom hos mennesker, som er forbundet med inntak av tropisk fisk som har akkumulert en bestemt type giftstoffer fra mikroskopiske alger, kalt ciguatoksiner (CTX). De mikroskopiske algene tilhører slekten Gambierdiscus eller Fukuyoa og lever på andre makroskopiske alger, sjøgress og koraller i rev. Fisk som spiser algene, forandrer den kjemiske strukturen til giftstoffene og gjør de muligens enda giftigere. Ciguateraforgiftningen har blitt et globalt problem grunnet internasjonal handel, så vel som spredning av de giftproduserende algene til mer tempererte vannområder. Det norskfinansierte prosjektet er tilknyttet et stort prosjekt, CiguaPIRE, finansiert av amerikanske National Science Foundation. CiguaPIRE ledes av Universitetet i Sør-Alabama som også er vår viktigste samarbeidspartner i prosjektet sammen med National Research Council of Canada og Universitetet i Oslo. Den første delen av våre bidrag til CiguaPIRE gikk ut på å kartlegge og tentativt identifisere forskjellige varianter av karibisk CTX i giftig fisk fra Mexico-bukten. Til dette brukte vi moderne metoder som inkluderer høytoppløsende massespektrometri. Arbeidet resulterte i at vi kunne beskrive den kjemiske strukturen til to nye varianter av karibisk ciguatoksin som finnes i fiskeprøvene, i tillegg til allerede kjente toksiner (C-CTX-1 og -2). Vi viste også til funn av enda flere varianter av giftstoffene i fiskeprøvene, men disse finnes sannsynligvis i mye lavere relativ konsentrasjon. Et stort gjennombrudd for teamet var oppdagelsen av et molekyl i en giftig alge som er forløpermolekylet til giftstoffet i fisk. Dette ble vist ved å isolere små mengder av stoffet fra en algekultur og utsette det til leverenzymer fra fisk som førte til produksjon av C-CTX-1/-2 i blandingen. Algetoksinet ble kalt C-CTX-5 og har svært lik struktur til giftstoffene i fisk. Oppdagelsen av C-CTX-5 vil gjøre det i framtiden mulig å lage større mengder med referansemateriale som trengs til analyse av ciguatoksin i potensielt giftige prøver siden det er vesentlig enklere å rense opp et toksin fra en algekultur enn fra giftig fisk. I dag detekteres toksinene oftest med en cellebasert metode, hvilket er en sensitiv, men lite selektiv metode. For å detektere toksinene på en mer selektiv måte, må man bruke kjemiske metoder, som eksempelvis massespektrometri. CTX er dessverre et molekyl som ikke enkelt lar seg analysere med denne teknikken. Derfor har vi utviklet nye metoder som gjør det lettere å detektere C-CTX-1 og -2 ved hjelp av en massespektrometrisk analyse. En metoden involverer at molekylet forandres kjemisk slik at en kan måle det ved ca. 40 ganger lavere konsentrasjoner. I en annen tilnærming, som ble ledet av National Research Council of Canada, ble toksinmolekylet markert med oksygen-18. På den måten kan en bestemme toksininnholdet i prøver enda mer selektiv og med bedre nøyaktighet. Mot slutten av 2019 samlet våre samarbeidspartnere ved Universitetet i Sør-Alabama inn fisk i Mexicobukten. Det ble laget enzympreparater fra fiskenes levre (såkalte mikrosomer) med formål om å studere hvordan karibiske CTX biotransformeres i fiskene. Dette arbeidet har resultert i ny, grunnleggende kunnskap. Vi har vist at både fisk fra Mexicobukten, samt Atlantisk laks, har evnen til å avgifte CTX ved å konjugere de med glukuronsyre. En slik biotransformasjon kunne ikke observeres når toksinene ble inkubert sammen med leverpreparater fra rotter eller mennesker. Det kan derfor virke som om evnen til å avgifte toksinene er en generell egenskap hos fisker, mens den mangler hos pattedyr. Det vil i så fall delvis kunne forklare hvorfor toksinene er så potente i mennesker. De samme enzympreparatene ble også benyttet til å vise at C-CTX-5 kan konverteres til C-CTX-1 i fisk.

1) The project has extented the knowledge on existing ciguatoxin variants and related neurotoxins considerably. This work culminated in the discovery of the algal precursor of Caribbean-CTX-1, the main analogue of the suite of Caribbean and Atlantic ciguatoxins in fish. 2) The project has increased the understanding of the chemical reactivity of Caribbean ciguatoxins, which is a prerequisite for improving detection methods and understanding biotransformation pathways. 3) Within the project, new methods have been developed that enable the detection of ciguatoxins with higher selectivity and accuracy. 4) The project has identified ciguatoxin-glucuronic acid biotransformation products in fish and shown that this type of biotransformation reactions does probably not occurr in humans, which could in part be the reason for the potency of the toxins in humans.

Ciguatera is caused by the consumption of reef fish that have accumulated ciguatoxins (CTXs). Precursors of CTX are produced by benthic dinoflagellates (Dinophyceae) in the genus Gambierdiscus that live on the marine substrates (e.g., on macroalgae, seagrasses) in coral reef ecosystems. These toxic precursors (secondary metabolites) are incidentally consumed by herbivorous grazers (marine invertebrates and fish) and the compounds are subsequently converted to more potent tertiary metabolites known as CTXs following bioaccumulation and metabolism within an organisms and further converted following trophic transfer through the food web. These mechanisms of biotransformation and food-web pathways are poorly understood but their elucidation is critical to developing monitoring approaches for public health protection. Given the extensive impacts that CFP has in affected communities and the global reach of this public health concern (via global trade), the resolution of these deficiencies and development of predictive capabilities are major research priorities. A better understanding of toxin production and flux into the food web needs to be acquired before proactive management actions can be established. The Norwegian tasks within the larger PIRE project are to contribute in the characterisation of the CTX metabolome of Gambierdiscus species as well as to participate in the structure elucidation of key algal and fish metabolites of CTXs. The Norwegian team has also the knowledge and capabilities to perform in vitro toxicokinetic trials using liver microsome preparations from practically any animal. Such in vitro approaches will be applied to study the biotransformation of algal CTXs in various fish species. Furthermore, the group at the Norwegian Veterinary Institute is among the world-leading teams regarding the design and preparation of antibodies for marine toxins. Such anti-CTX antibodies will be raised within the project and applied in different assay formats.