Tolerance of Atlantic salmon to novel feed mycotoxins- Implications on fish performance and nutrient interactions

Bruk av nye fôrråvarer i laksefôr byr på nye utfordringer i forhold til giftstoffer som tidligere ikke var assosiert med lakseoppdrett. Overvåkning av plantebaserte fôringredienser som per i dag blir brukt i laksefôr, samt nye fôringredienser som insektmel, har vist forekomst av nye soppmygg-gifter (mykotoksiner) som beauvericin (Bea) og enniatiner (Enn). I motsetning til de mer studerte mykotoksinene, er disse «nye» mykotoksinene mer fett-løselig, noe som øker muligheten for at de akkumuleres i fisken. Til nå er det ikke satt noen øvre grenser for disse mykotoksinene i dyrefôr. AquaMyc prosjektet tar sikte på å undersøke virkningen av nye fôrforurensninger (fremvoksende mykotoksiner) på atlantisk laks helse og vekst. Vi har brukt in vivo og in vitro studier i et system biologiske rammeverk for å danne et helhetlig bilde av de fysiologiske konsekvensene eksponering til disse mykotoksinene kan påfører laksen. Overføring av mykotoksiner til spiselige deler av fisken ble også undersøkt Akutt eksponeringsforsøk og subkronisk (3 mnd) fôringsforsøk med laks ble utført for å undersøke hvor mye av mykotoksinene EnnB og Bea laks kan tåle før negative effekter oppstår. Disse forsøkene viste at selv om de begge viser noenlunde lik giftighet, hadde de ulike effekter på veksten. Gruppen som hadde fått Bea i fôret ble tynnere (redusert kondisjonsfaktor) til tross for at den spiste mer enn kontrollgruppen. Dette indikerer at høye nivåer av Bea i fôret går ut over fôrutnyttelsen og næringsopptaket. Dårlig fôrutnyttelse kan skyldes både økt energiomsetning (behov for mer energi) og dårlig næringsopptak. Videre studier av laksetarmen viste økt tarmlekkasje, også ved lave konsentrasjoner, noe som kan gi et redusert næringsopptak. Sterkt reduserte nivåer av vitamin E (en viktig antioksidant) ble også observert i lever fra de samme dyrene. Selv om det ikke ble observert signifikante effekter på tarm som følge av EnnB i fôret, hadde EnnB en markant effekt på lengdevekst, allerede ved de laveste dosene. Dette sees i sammenheng med økt forekomst av skjelettdeformiteter i gruppen som hadde høyest nivå av EnnB i fôret. I tillegg viste de innledende studier på beinceller redusert mineralisering som følge av EnnB. Det er kjent at redusert mineralisering av skjelettet kan gi opphav til skjelettskader. Leverskade ble også observert i ENNB gruppene. I tillegg til vekst observerte vi redusert blodprosent allerede etter 1.5 måneder hos laks fôret med EnnB og Bea. Dette er et klart tegn på at noe er gale og kan være alvorlig hvis det går over lang tid. Overaskende, var denne effekten forsvunnet på slutten av forsøket (3 måneder) hos Bea-gruppen men ikke hos EnnB gruppen. Det kan derfor virke som om fisken er mer sensitiv ovenfor EnnB enn Bea. Andre in vivo og in vitro studier utført i prosjektet viser at reduksjonen i røde blodceller er forbundet med forstyrring av produksjon av heme (viktig for blant annet hemoglobin). Celle studiene viste at hoved mekanismen bak den observerte toksisiteten var forstyrring av membranpotensialet i mitokondriene og lysosomene. Vi så også at dette var knyttet opp mot forstyrring av jernbalansen i cellen noe som førte til ferroptose, en type celledød. In vitro forsøk viste også at stoffene ikke forstyrret eller hindret den cellulære immunresponsen mot virus og bakterier, men kunne i seg selv sette i gang inflammasjonssignaler. Dette kan gjøre laksen mer sårbar for inflammasjonsrelaterte lidelser, men vi så ingen klare indikasjoner på inflammasjon i tarmen etter 3 måneder fôring, selv ved den høyeste dosen. i forbindelse med prosjektet har vi også utviklet et PCR basert assay for genskade. Selv om assayet viste at høye doser av Ennb og Bea kunne gi genskader, tror vi at dette er begynnende celledød og ikke genotoksisitet ved lave doser Et av hovedmålene til prosjektet var å beregne trygge nivåer av de to mykotoksinene i fôr til laks. Standard prosedyrer ble brukt til risikovurderingen. Våre data indikerer at nivåene man finner av EnnB i enkelte prøver av laksefôr og fôringredienser kan utgjøre en risiko for fiskehelsen. Basert på nåværende data er det mindre sannsynlig at Bea vil utgjøre en risiko. Prosjektet viser også at disse stoffene ikke akkumulerer i den spiselige delen (muskel) eller andre organer i laksen. Enniatin og beauvericin i fiskefôr vil derfor mest sannsynlig ikke utgjøre noe fare for konsumenter av laks. De nevnte forsøkene undersøkte effekten av enkelt-toksiner, men en oppsummering av nivåer av ENNB og BEA i laksefôr gjort som en del av prosjektet viser derimot at de sjeldent forekommer alene. Hvis det er høye nivåer av EnnB kan det også være høye nivåer av andre mykotoksiner og andre former av enniatiner. Grunnet strukturlikheter mellom ENNB, BEA og andre enniatiner er det mulig at disse virker på samme måte og vil føre til en akkumulert effekt på blod, lever og vekst.

Outcome: • In the AquaMyc project we have established the levels of enniatin B (ENNB) and beauvericin (BEA) which are safe for salmon. • Using the knowledge gained from the project we were able to do a risk assessment based on the current level of ENNB and BEA in salmon feed and give advice on the risk for salmon health. • In this project we established that the two mycotoxins did not accumulate in muscle and only trace amounts were found in salmon. From this we concluded that ENNB and BEA levels in feed does not constitute a risk for the end consumer. • With the help of the Aquamyc project, we have established evidence for novel mechanisms of which ENNB and BEA exert damage towards the cell (ferroptosis and disruption of iron/heme homeostasis). • The following toxic endpoints have been established for enniatin and beauvericin exposure: o Reduction in red blood cells, (BEA, ENNB) o Liver damage, (ENNB) o Intestinal leakage (BEA) o Reduction in feed conversion (BEA) o Reduced mineralization (ENNB/BEA) o Stimulation of inflammatory cascade (TNFa) o Growth (BEA/ENNB) • A sigmoid dose response at lower doses were identified. • An assay/setup for measuring intestinal leakage in salmon by modifying a method used on mice was established. • A qPCR-based method has been developed for measuring DNA damage in salmon. • The project has generated 3 master students and one PhD student (waiting for the opponents report) • In the project we have 5 scientific publications of which two are published and three are under review. Four additional manuscripts are under preparation. Impact • We anticipate that the established levels will be used by the food authorities for setting guidance values for ENNB and BEA in salmon feed. Guidance values have been set for most other more common mycotoxins. • Feed producers has until now had a focus on the legislative regulated mycotoxins (DON, OTA, Aphlatoxin, ZEA EtC) this has also been the focus for the global feed surveillance (BIOMIN). Our results have made feed producers aware of the importance of controlling the levels of ENNB in particular in the feed and feed commodities. • The novel mechanisms of toxicity have helped to move the understanding of ENNB and BEA toxicity forward, not only for salmon, but also for mammals. Previous works have mostly focused on the mitochondrial perturbation. We show that low level exposures can exert different adverse effects through different mechanisms in comparison to cytotoxic dose levels. • The setup for measuring intestinal leakage ex vivo in salmon will be used in future studies. • Our novel findings regarding mode of action involving disturbance of heme biosynthesis with reduced red blood cell levels as adverse outcome has moved the research front forward. • The developed Salmon DNA damage assay will be used in other studies.

The use of new feed ingredients will also introduce new challenges to the farmed salmon such as contaminants and anti-nutrients, not early associated with the farming of marine carnivorous fish such as Atlantic salmon. Screening of currently used Norwegian salmon plant-based feeds as well as novel insect feed ingredients showed the presence new mycotoxins such as beauvericin (BEA) and enniatins (ENN). In contrary to more studied mycotoxins, these new emerging compounds are fat soluble and are recently been reported to be present in farmed marine fish. At present, there is knowledge gap on the implication of these emerging mycotoxins on salmon health and welfare, or their potential transfer from feed to fillet. No upper limits are set for these mycotoxins in animal feeds. From in vitro and mammalian and poultry studies it is know that emerging mycotoxins has a potential for generating oxidative stress, osteotoxicity, immunotoxicity and can interfere with cholesterol and vitamin A metabolism. The current proposal aims to investigating the impact of new feed contaminants (emerging mycotoxins) on vitamin requirement, as well as lipid metabolism, growth, health and immune-responses in Atlantic salmon. In addition to these targeted endpoints, system biology approaches applying the salmon genome will be used to gain fundamental knowledge on the interaction between mycotoxins and nutrients. We will use both state of the art salmon in vitro assays and conduct a feeding experiment in order to investigate the tolerance of Atlantic salmon for newly identified fat soluble mycotoxins in novel sustainable feeds.