ERA-NET: Synthetic Biology for Industrial Production of Steroids

Steroid farmasøytika er, nest etter antibiotika, den største klassen av legemidler til medsinsk bruk. De er viktige for livskvalitet, sunn utvikling og aldring. Mer enn 300 steroid¬forbindelser er klinisk godkjente. Disse inkluderer steroider som hydrokortison, testosteron og prednisolon. Det samlede markedet er på 10 milliarder USD. En del bakterier i gruppen aktinobakterier kan vokse på steroler fra planter (såkalte fytosteroler), og mutanter av disse kan omdanne fytosteroler til steroider eller steroidforbindelser som kan modifiseres videre til medisinske steroidforbindelser. Produksjonen av disse mikrobielle steroidstrukturene er industrielt implementert, men det er fortsatt mange utfordringer. Høyere utbytte av ønsket produkt og færre og mindre dannelse av biprodukter er viktige stikkord. I Syntheroids-prosjektet er det overordnede målet å etablere miljøvennlig og økonomisk produksjon av steroider. Viktige delmål er (1) å lage nye steroidforbindelser i en 1-trinns bioprosess, (2) å effektivisere bioprosessen, (3) å lage nye mutanter med høyere toleranse for sluttproduktet, og (4) å forenkle opprensingen av produktene ved å lage mutanter som danner mindre og færre biprodukter. Prosjektet er et samarbeid mellom industri og forskningsmiljøer med partnere fra Norge, Spania, Tyskland og Russland. SINTEF fikk tilsendt utvalgte stammer fra sine samarbeidspartnere. I SINTEF har vi etablert kultiveringsprotokoller i forskjellige skalaer (fra brønnplater via rystekolber til fermentorer) ved hjelp av forbedrete kjemiske definerte medier. Slike medier uten komplekse komponenter brukes for å kunne forstå en bioprosess bedre. I Syntheroids prosjektet ble stammer kultivert i definerte medier i laboratorie-skala fermentorer for å øke forståelse av den bakterielle fytosterol konverteringsprosessen ved hjelp av dybdeanalyse av stammer og analyse av bioprosessen (bruk av 'omics teknologi). SINTEF gjennomførte fermenteringer and tok prøver. Metabolitter ble analysert i huset ved å bruke massespektrometri-baserte metoder. Prøver til proteomikk og transkriptomikk ble sent til analyse hos partnere for å identifisere gener for stammeutvikling med det overordnete målet om å lage mutanter som produserer færre biprodukter. En annen oppgave var å identifisere gener i en utvalgt stamme som kan modifiseres for å oppnå økt toleranse mot steroid produktene. Først ble et mutantbibliotek laget ved hjelp av et kjemisk mutagen. Parallelt ble seleksjonsprosedyrer utviklet for å identifisere mutanter med økt toleranse. Disse omfattet en anrikning av mutanter i medier som inneholdte et nøkkel steroid produkt etterfulgt av fluorescens farging og sortering av overlevende bakterier med fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) i tillegg til bruk av agar-baserte medier som inneholdte økende konsentrasjoner av steroid produktet. Hele mutantbiblioteket ble screenet og lovende mutanter fra screenet ble karakterisert i vekstmedier med fytosterol og/eller steroid. Vekst av mutanter ble fulgt i brønnplater og mikrobioreaktorer. Flere mutanter viste økt vekst i nærvær av steroidproduktet. For å følge fytosterol konvertering ble prøver tatt med jevne mellomrom og analysert. Til dette formålet ble det brukt robotisert ekstrahering av sterolene og steroidene etterfulgt av en hurtig (RapidFire, ca 8 sekunder per analyse) MS-basert analyse av utvalgte forbindelser. Til slutt ble genomer av 5 utvalgt e mutanter sekvensert ved bruk av SINTEF's Illumina MiSeq instrumentet og underliggende mutasjoner ble funnet for å finne kandidatgener for fremtidig genetisk modifisering for å lage stammer med økt steroidtoleranse. Noen utvalgte gener fra denne tilnærmingen ble også tidligere identifisert i en proteomikk-basert tilnærming som ble gjort hos en an våre spanske partnere. I tillegg har SINTEF analysert steroider i prøver tilsendt fra våre partnere vha bla massespektrometri og NMR for å studere ukjente steroid produkter.

- Prosjektet har vært en fortsettelse av et tidligere prosjekt (MySterI ERA-IB-2) og har dermed økt samarbeidet mellom forsknings- og industripartnerne ytterligere. Konsortiet ser etter mulighet for videre samarbeid gjennom nye prosjekt. - Prosjektet kunne demonstrere at fornybare råstoffer kan bli omdannet til verdifulle medisinske produkter. - Prosjektet har skapt økt kunnskap og vitenskapelig kompetanse både mht metodeetablering (f.eks. screening pipeline) og resultater som har blitt publisert og skal publiseres både i tidskrifter og en bok. - Prosjektets resultater i sin helhet bidrar med å gi industripartnerne økt konkurransekraft på markedet.

Steroids are the second largest class of drugs marketed for medical applications, only exceeded by antibiotics. Currently, there are more than 300 clinically approved steroidal compounds, representing a 10 billion USD market. Although the production of key steroid intermediates (mainly C19-steroids) from phytosterols has been industrially implemented, there is still considerable room for improvement and many challenges remain. The generation of effective engineered strains, improved bioprocess efficiency, improved product recovery, and the problem of end-product inhibition are major challenges for the industry. The Syntheroids project aims to develop integrative processes for innovative bioconversion of phytosterols to C22-steroids based on Synthetic Biology of non-pathogenic Actinobacteria (Mycobacterium, Nocardioides). These compounds are key intermediates in the synthesis of several therapeutic steroids applied in gastroenterology and endocrinology. Steroid pharmaceuticals are important for life quality, healthy development and ageing, all major challenges today. Production of key intermediates for the synthesis of therapeutic steroids, in an eco-friendly and economical process, is the main expected result of Syntheroids. A few steroid precursors are today industrially produced from phytosterols, mainly by companies in China, India and the US, although some are located in Europe. All in fierce and keen competition. Innovative ideas that can expand the list of steroids produced from phytosterols in a single-step biotechnological process are wanted, and this is why two European companies (Bionice and Pharmins ltd.) are active partners in the five-partner Consortium Syntheroids. Shorter steroid production pipelines and eco-friendly processes, in compliance with European regulations, will increase the EU-GDP (gross domestic product) as it will increase the companies' competitiveness and reduce the end drug user's medical invoice.