Deciphering enzyme mechanisms by neutron crystallography in combination with complementary methods

For å forstå den detaljerte funksjonen til biologiske systemer er det meget viktig å bruke metoder som kan zoome seg ned på et atomært og elektronisk nivå for å beskrive slike systemer i detalj. Her vil flere forskjellige biokjemiske og biofysikalske metoder benyttes. Hovedmetoden for å få strukturinformasjon om proteiner og enzymer er røntgendiffraksjon, men denne metoden har noen begrensinger. Røntgenstrålingen som brukes kan skade prøvene og føre til endring i oksidasjonstilstand, og i tillegg kan metoden vanligvis ikke gi posisjonen til hydrogenene. Hydrogenene er meget viktig for å forstå mekanismen til mange enzymer. Å endre strålekilden fra røntgen til nøytroner vil løse disse problemene, men man vil da også trenge mye større prøver (i dette tilfellet krystaller), og mye lenger datainnsamlingstid. Dette prosjektet fokuserer på å bygge kompetanse innen nøytrondiffraksjon for å studere proteiner, og kombinere det med røntgendiffraksjon og komplementerende spektroskopiske teknikker som UV-vis og Raman spektroskopi. Til dette er både et hem- og et flavinprotein system valgt ut som modellsystemer. Prosjektet vil gjennom å bygge kompetanse i nøytrondiffraksjon kunne svare på noen sentrale biologiske spørsmål vedrørende disse proteinmodellsystemene. For myoglobin hemsystemet er både spermasethvalmyoglobin og to myoglobinvarianter fra gullfisk klonet og uttrykt. Vi har krystaller av hestehjertemyoglobin, men forsøker å finne ny krystalliseringsbetingelse som kan gi større krystaller. For spermasethval og gullfisk myoglobin så har en variant blitt renset og krystalliseringsforsøk pågår, men den andre varianten har et lavt uttrykk og den tredje varianten uttrykker en inaktiv form. Det arbeides med å løse disse problemene. For flavinsystemet har vi krystallisert, løst og publisert røntgenstrukturen til et nytt flavoprotein, og arbeider med å optimalisere krystalliseringsbetingelsene for å kunne gro krystaller som er anvendbare for nøytrondiffraksjon.

To be able to understand complex biological systems and how they function, it is essential that one can describe them on an atomic and electronic level. In biological processes proteins perform the chemical reactions in biological systems by acting as a catalyst and are involved in modification, build-up or break-down of different compounds needed by the cells. To enhance the understanding of these biological systems X-ray diffraction has to be combined with many different biochemical and biophysical methods. One limitation with X-ray diffraction is that hydrogens are normally not visible since the X-rays are scattered by the electrons, and therefore an essential information for deciphering reaction mechanism is missing. To be able to observe the hydrogens/protons, the X-rays can be exchanged with neutrons, which instead are scattered by the nuclei. In neutron protein crystallography, both hydrogen and deuterium are resolved since the hydrogen have a relative strong negative scattering length, while deuterium have positive scattering length. For metalloprotein and other redox cofactor proteins, the neutron diffraction have an additional advantage since it does not lead to radiation damage. Two main redox cofactor protein systems have been selected. One focusing on a haem protein system, and the other on a flavin protein system. We will through the neutron cryo-crystallography studies gain new insight into the peroxidase reaction in myoglobin and the electron transfer mechanism of flavodoxins. The ambition of the project will be to both developing competence in neutron protein crystallography, to develop the combination with X-ray protein crystallography, the combination with single-crystal spectroscopy, and deciphering the mechanism and function of some key redox cofactor enzyme systems.