FRIPRO-Fri prosjektstøtte

Aspergilloser er blant de vanligste menneskelige soppinfeksjonene og forårsaker mer enn en million dødsfall hvert år. De luftbårne sporene (conidia) fra Aspergillus fumigatus er alltid tilstede i omgivelsene, men hos personer med et normalt immunsystem fører de ikke til sykdom. Imidlertid er A. fumigatus infeksjoner en alvorlig trussel mot immunkompromitterte pasienter. Spekteret av soppdrepende medisiner er ganske begrenset og utvikling av resistens er et økende problem. Vi har nylig oppdaget et protein på overflaten av conidia som muligens har en sentral rolle i infeksjonsprossesen. Proteinet bryter ned et molekyl som er essensielt for vertsorganismens metabolisme. Vi antar at denne katalytiske aktiviteten er avgjørende for soppens evne til å beskytte seg mot immunforsvaret. Prosjektet tar sikte på å etablere de strukturelle og funksjonelle egenskapene til proteinet. Ved hjelp av et bredt spekter av infeksjonsanalyser og molekylærgenetiske verktøy vil vi dessuten være i stand til å utarbeide proteinets potensial som et nytt medikamentmål. Vi har også som mål å identifisere første generasjons kjemiske forbindelser som hemmer den enzymatiske aktiviteten til proteinet, dermed kan vi muligens etablere nye soppdrepende medisiner. I løpet av prosjektets første år har vi oppnådd to kritiske mål som gir grunnlaget for en vellykket videreføring. Først klarte vi å produsere store mengder av A. fumigatus NAD-nedbrytende enzym, og dermed muliggjøre omfattende strukturelle og funksjonelle undersøkelser. Dette trinnet var utfordrende, og vi måtte ty til en backup -løsning for å etablere et passende system. For det andre, basert på tilgjengeligheten av det rensede proteinet, var vi i stand til å skaffe krystaller som var av tilstrekkelig høy kvalitet for strukturelle analyser med høy oppløsning ved bruk av røntgendiffraksjon. Disse analysene etablerte den første tredimensjonale strukturen til en sopp-NADase og identifiserte dens unike evolusjonære forekomst. Vi har nå begynt detaljerte strukturelle og funksjonelle studier av det homodimere enzymet fra A. fumigatus. Overraskende nok identifiserte vi et kalsiumbindingssted i hver av underenhetene. Ved å bruke stedsrettet mutagenese, enzymatiske og strukturelle analyser fant vi at kalsiumbinding medierer konformasjonsendringer i proteinet som fremmer katalyse. Kalsiumbinding kan være en del av en mekanisme som regulerer katalytisk aktivitet som respons på miljøforhold. Vi identifiserte og validerte også gener som koder for overflate-NADaser i plantepatogenet Fusarium oxysporum og den røde brødmuggen Neurospora crassa. Selv om de katalytiske og generelle strukturelle egenskapene til disse enzymene ser ut til å være lik egenskapene til A. fumigatus-proteinet, er individuelle egenskaper forskjellige, for eksempel mangel på et kalsiumbindingssete. Derfor, selv om den biologiske funksjonen til disse NADasene kan være lik i forskjellige sopp, kan mekanismene som regulerer deres enzymatiske aktivitet være forskjellige. I forrige prosjektperiode etablerte vi med suksess laboratorieprotokoller for å opprettholde proteinstabilitet og enzymaktivitet og validerte egnede forhold for proteinkrystallisering. Derfor kunne vi i den nåværende prosjektperioden fokusere på tre hovedaspekter. Først har vi identifisert den molekylære mekanismen for hvordan det unike kalsiumbindingssetet i A. fumigatus-proteinet virker for å stabilisere den totale proteinstrukturen og hvordan endringer i kalsiumbinding kan overføres til det katalytiske senteret. Disse viktige innsiktene ble oppnådd fra analyser av genererte røntgenstrukturer som representerte de kalsiumbundne og -ubundne proteinformene. Dessuten ble ulike biofysiske metoder brukt for å konsolidere resultatene. For det andre var vi i stand til å krystallisere Fusarium-enzymet og en litt modifisert form av Neurospora-enzymet. Deretter vil vi analysere disse strukturene grundig for å forstå likheter og forskjeller mellom disse enzymene i de forskjellige kladdene. For eksempel vil det være viktig å fastslå hvor like de katalytiske setene til disse enzymene er, fordi dette vil ha en umiddelbar innvirkning på strategien for å identifisere spesifikke inhibitorer. For det tredje har vi utviklet biokjemiske og biofysiske analyser som muliggjør nøyaktige målinger av enzymets stabilitet og aktivitet selv ved lave substratkonsentrasjoner. Sammen med de ovennevnte protokollene for å produsere stabile proteiner har vi generert de proteinkjemiske forutsetningene for å vurdere foreløpig screening for modulatorer av enzymaktivitet, som vil være en oppgave i den kommende prosjektperioden.

Aspergilloses are among the most common human fungal infections and cause more than one million deaths every year. The airborne spores (conidia) of Aspergillus fumigatus are ubiquitously present in the environment and normally cleared from the lungs by the immune system. However, A. fumigatus infections represent a serious threat in immune-compromised patients with a lethality of up to 90%. The spectrum of antifungal drugs is rather limited and development of resistance has become a major challenge for the treatment of these infections. This proposal is based on our recent (unpublished) discovery of an NAD-cleaving enzyme (AfNADase) on the surface of conidia from Aspergillus fumigatus. Importantly, earlier virulence studies have indicated a prominent role of the encoding gene in the infection process; however, the function of the gene product has remained unknown. We hypothesize that the NADase activity may be critical for the adherence to the host cells or to evade the immune system. Our preliminary observations indicate that AfNADase represents a new class of enzymes with homologous representatives only in spore-forming fungi making it a promising drug target. In collaboration with internationally leading research groups, we will establish the molecular and catalytic properties of this new enzyme class including the X-ray structure. Moreover, we will use molecular genetics and a range of functional assays, including mouse models of A. fumigatus infection, to establish the biological function of AfNADase as well as its role in the infection process. Finally, we will produce a range of NAD analogs and test their inhibitory effect on AfNADase. Using effective analogs in biological assays, we intend to verify the suitability of AfNADase as a target for the treatment of aspergilloses and, potentially, other fungal infections.