ERA-NET: Bluebio Microbial management in RAS for sustainable aquaculture production

Resirkulerende akvakultursystemer (RAS) har mange fordeler sammenliknet med tradisjonelle gjennomstrømningssystemer og er nå den foretrukne teknologien for produksjon av settefisk i Norge. For at vannet skal kunne gjenbrukes i RAS, må det renses. Sentralt i denne rensinga er biofiltre, der saktevoksende mikrober omdanner det giftige avfallsproduktet ammonium til nitrat. Bakterier er dermed essensielle for den kjemiske vannkvaliteten. Konsentrasjonen av nitrat in RAS-vannet kontrolleres vanligvis ved vannutskifting. En god mikrobielle vannkvalitet må også opprettholdes for å sikre sunne og gode betingelser for fisken. Dette innebærer fravær av patogene og opportunistiske bakterier. Så lenge det finnes substrat og næringsstoffer i vannet, vil bakterier alltid vokse i RAS-vannet, og desinfisering i RAS-sløyfa vil ikke alene hindre bakterievekst. Hvordan en god mikrobiell vannkvalitet skal opprettholdes, er derfor ikke opplagt. Dette prosjektet har vært en del av Bluebio-prosjektet RASbiome, med partnere ved DTU Aqua og Universitetet i Gent. En viktig del av prosjektet var å undersøke om det er mulig å forbedre håndteringen av nitrogenforbindelser i RAS ved å benytte alternativer til nitrifikasjon i den biologiske vannrensinga, mer spesifikt ved hjelp av prosesser som kan fjerne nitrogen (N) fra vann: delvis nitrifisering kombinert med anammox (PNA) og heterotrof nitrogen-assimilering (Het-N). De overordnede målsetningene for den norske forskningsaktiviteten var: 1) Å kartlegge mikrobielle samfunn og omdanninger i kommersielle RAS for produksjon av smolt, 2) Å adaptere et biofilter basert på PNA til RAS-relevante betingelser og implementere det i et eksperimentelt RAS, og 3) å evaluere mikrobiell vannkvalitet i RAS med nye prosesser for mikrobiologisk omdanning av ammoniakk. Vi undersøkte to identiske RAS i et anlegg for kommersiell produksjon av lakseyngel av ulike størrelse. Vannprøver ble analysert med hensyn til partikler, karbon-,N- og fosfor-forbindelser, og bakteriesamfunn. For prøver av biofilm i biofiltre («fixed-bed» og «moving-bed», samt rislefilter) karakteriserte vi bakterie- og arke-samfunn. Vi fant høy relativ forekomst (20-30%) og høy diversitet av Nitrospira i biofiltrenes biofilmer, og noe overraskende, også i rislefiltrene. Forekomsten av ammonium-oksyderende bakterier var lav, men karakterisering av arkea-samfunn viste at Nitrosopumilus trolig var en viktig ammonium-oksyderende mikrobe i biofiltrene. Vi benyttet kontinuerlige moving-bed-bioreaktorer (MBBR) med aktive PNA biofilmbærere til å undersøke ulike strategier for å adaptere en PNA-basert prosess til lave konsentrasjoner av ammonium. Bærerne kom fra en prosess for rensing av vann med svært høye konsentrasjoner av ammonium og organisk materiale (hhv. 800 mg TAN/L og 3000 mg COD/L). Vi lyktes i å oppnå en stabil PNA-prosess i MBBR ved konsentrasjoner så lave som 10 mg TAN/L («total ammonia N»). Så langt vi kjenner til, er det ikke rapportert om effektiv anammox-prosess ved så lave TAN-konsentrasjoner tidligere. Karakterisering av mikrobielle biofilmsamfunn viste en svært høy forekomst og diversitet (trolig over 2000 populasjoner) av Planctomycetes, det fylumet som omfatter alle kjente anammox-bakterier. Overraskende nok lyktes vi med å oppnå PNA ved å bruke lave TAN-konsentrasjoner allerede fra start. I en annen MBBR, der vi reduserte TAN-konsentrasjone gradvis utviklet det seg nitrifikasjon i reaktorene istedenfor PNA. Vi prøvde også å oppnå rene anammox-prosesser to anaerobe MBBR’er. Også her ble vi overrasket over å se at en plutselig eksponering til lave TAN-konsentrasjoner resulterte i en effektiv anammox-prosess, mens en gradvis reduksjon i TAN-konsentrasjonen resulterte i full nitrifisering, selv under strengt anaerobe betingelser. Vi innførte den MBBR’en som viste en god og stabil PNA-prosess til et enkelt resirkulerende system uten fisk, men dette førte til at nitrifikasjon dominerte og at anammox-aktiviteten gikk tapt. Dette skyldtes trolig høy O2-konsentrasjon. En videre utvikling av PNA for bruk i RAS må adressere utfordringen med høye O2-konsentrasjon. En viktig del av prosjektet var å evaluere den mikrobielle vannkvaliteten i RAS der vi benyttet alternativer til nitrifikasjon i den biologiske vannrensingen. Vår prosjektpartner ved DTU Aqua utviklet en ny prosess for biologisk vannrensing i RAS. De brukte biopellets som støtte for biofilmvekst, og lyktes med å fjerne N fra vannet ved heterotrof N-assimilering. Vi undersøkte den mikrobielle vannkvaliteten ved hjelp av flow-cytometri. Ved å farge bakteriecellenes RNA-innhold, kunne vi anslå andelen av hurtigvoksende, potensielt opportunistiske populasjoner i bakteriesamfunnene. Dette var en effektiv metode. Vi fant at andelen slike hurtigvoksende bakterier var lav i et tradisjonelt RAS med et nitrifiserende biofilter, mens det var signifikant høyere i RAS basert på Het-N. Dette bør tas med i betraktning i en eventuell videre utvikling av Het-N-teknologien.

We obtained a detailed data set for two commercial RAS with salmon fry, sampled at three dates, including the concentrations of dissolved and particulate nitrogen, carbon, and phosphorus compounds, the abundance and size distribution of particles, and a detailed description of bacterial communities suspended in the RAS water, in addition to archaeal and bacterial biofilm communities in trickling filters, and moving-bed and fixed-bed biofilters. The results demonstrate key roles in nitrification for Nitrospira and ammonia-oxidizing archaea classified as Nitrosopumilus. Thus, our results emphasize the need for including Archaea when mapping nitrifying communities in RAS. We successfully adapted a microbial process based on partial nitrification and anammox (PNA) for conversion of ammonia to nitrogen gas at low ammonia concentrations (10 mg/L). This was obtained in a moving-bed bioreactor that was operated for over six months. We proved that an adaptation strategy based on gradual decrease of ammonia concentrations led to full nitrification and loss of the anammox activity, even under anaerobic conditions. However, we failed in implementing this treatment process in RAS. A main challenge is the high concentrations of dissolved oxygen, and this needs to be addressed in further developments. We consider the technology to have reached a TRL 2. Still, this development might be applicable to other treatment processes, yet to be identified. We also achieved a detailed characterization of the bacterial biofilm communities of the PNA and anammox reactors. This brought new insight about anammox communities, such as the extreme diversity of Plactomycetes (probably more than 2000 populations). We demonstrated that a simple and quick flow-cytometry-based approach could be used to assess the microbial water quality in aquaculture systems. This has a large applied potential, which will be further examined in new projects in collaboration with relevant industry partners.

In RASbiome, we aim at improving the sustainability of fish production in freshwater recirculating aquaculture systems (RAS). We will investigate microbiomes in RAS in relation to chemical and microbial water quality in commercial RAS, and implement two fundamentally distinct biological water treatment strategies to improve the management of nitrogen compounds in RAS. The first strategy involves anaerobic ammonia-oxidizing (anammox) bacteria in a process expected to remove nitrogen from the water without addition of organic carbon, at reduced energy and water consumption and CO2 production. The second strategy takes advantage of heterotrophic bacteria which assimilates nitrogen. This approach allows for harvesting nutrient rich sludge and is therefore compatible with recovery and recycling of nitrogen from in RAS water. Both biological treatment processes will capture dissolved N and lead to a reduced N-footprint. Furthermore, we will optimize microbial water quality by reducing the risk for blooms of opportunistic/pathogenic bacteria by implementing these new biological treatment approaches in well-considered treatment designs. The project is highly transdisciplinary, and involves experts from Belgium, Denmark, and Norway in fields like environmental engineering, biotechnology, microbiology, microbial ecology, and aquaculture. Industry partners, including two large commercial producers of salmon smolt and rainbow trout, and Krüger Kaldnes, supplier of RAS technology, play a crucial role in the project. We expect the proposed project to promote sustainable fish production by improving fish welfare and productivity due to stable and optimized chemical and microbiological water quality, by reducing environmental impact through nitrogen removal from discharged water, and by reducing operational costs. Thus, the project contributes in developing European aquaculture in a direction characterized by the 3R principle: reducing, reusing and recycling of waste material.