SPORE NANOFIBER: Exploring novel extremely heat and chemically resilient nanofibers expressed on bacterial spores

Sporene er bakterienes svar på ugjestmilde miljøer, og fungerer som små overlevelseskapsler som kan overleve i årevis under ekstreme forhold som varme, kulde, tørke og til og med desinfeksjonsmidler. Sporer fra Bacillus cereus (B. cereus)-gruppen evne til å overleve prosessering av mat er et stort problem for matindustrien, samtidig som de kan utgjøre en risiko i medisinske og forsvarsrelaterte sammenhenger. Det er disse sporene som vi undersøker i prosjektet SPORE NANOFIBER. Spesielt har vi satt søkelys på fibrene som dekker overflaten av sporene, kalt ENA-fibre (Endospore Appendages). ENA-fibre er mikroskopiske strukturer – de er så små at de er usynlige for det blotte øye, med en bredde målt i nanometer og en lengde på mikrometer. Til tross for deres beskjedne størrelse har de en enorm innvirkning på sporenes evne til å overleve og tilpasse seg miljøet. Tidligere visste vi kun om én type ENA-fiber, kjent som S-ENA, som er til stede i alle arter innen B. cereus-gruppen. I 2023 startet vi en systematisk undersøkelse for å forstå disse fibrene dypere. Ved hjelp av kryo-elektronmikroskopi – en teknikk som fryser fibrene i deres naturlige tilstand før de blir analysert – kunne vi avdekke detaljer i fibrenes struktur som aldri tidligere har vært observert. Vi oppdaget også en helt ny type ENA-fiber, som vi har kalt L-ENA (Ladder-like ENA) på grunn av deres unike stige-lignende form. L-ENA-fibrene ser ikke bare annerledes ut enn S-ENA, men våre funn tyder på at de også spiller en viktig rolle i sporeaggregering, altså prosessen hvor sporer klumper seg sammen i tette klynger. Dette er spesielt relevant når vi studerer B. cereus-sporer isolert fra syke mennesker, hvor L-ENA-fibrene er mer fremtredende. Vi tror at disse fibrene kan være avgjørende i infeksjonsprosesser, noe som kan forklare hvorfor noen varianter av B. cereus er mer aggressive enn andre. For å forstå hvordan ENA fibrene fungerer, har vi tatt i bruk en rekke avanserte teknikker. Laserpinsetter gir oss muligheten til å manipulere individuelle fibre og observere deres oppførsel, mens genteknologi lar oss lage mutant sporer hvor vi har fjernet eller endret visse proteiner knyttet til ENA fibrene. Ved å kombinere disse teknikkene har vi gjort noen spennende funn. Det viser seg at L-ENA-fibrene har en liten tippfibrill, kalt L-BclA, for å kunne utføre sin aggregeringsfunksjon. Når vi fjernet L-BclA fra sporene, mistet L-ENA-fibrene evnen til å koble sporene sammen. Enda mer overraskende var det at L-BclA også er til stede på S-ENA-fibrene, noe som antyder at disse fibrene deler funksjoner. Vi har også undersøkt hvordan ENA-fibrene påvirker sporenes evne til å feste seg til ulike overflater. I matindustrien er dette spesielt relevant, da sporer kan feste seg til produksjonsutstyr og overleve rengjøringsprosesser, noe som øker risikoen for kontaminasjon. Vi har funnet at ENA-fibrene er spesielt gode på å hjelpe sporene å feste seg til materialer som polypropylen og rustfritt stål – materialer som er vanlige i produksjonsmiljøer – mens de har mindre evne til å feste seg til overflater som polystyren og glass. Dette gir oss viktig innsikt som kan brukes til å forbedre hygieneprotokoller i matproduksjonsanlegg. Ved å forstå hvilke materialer sporene lettere fester seg til og hvordan man kan forhindre at de fester seg, kan industrien ta bedre valg for å redusere risikoen for B. cereus-kontaminering, noe som er avgjørende for å sikre mattryggheten og forbedre kvaliteten hos produktene. Dette prosjektet har allerede gitt oss verdifulle innsikter, men vi er fortsatt i starten av å forstå det fulle omfanget av hva ENA-fibrene kan gjøre. Våre funn har blitt presentert på nasjonale og internasjonale konferanser, og de har allerede blitt publisert i to fagfellevurderte artikler i anerkjente vitenskapelige tidsskrifter. Vi har også flere spennende nye oppdagelser. Blant annet arbeider vi nå med å forstå ENA-fibrenes rolle i biofilmdannelse – et fenomen hvor bakterier danner beskyttende lag på overflater, noe som kan øke deres motstandsdyktighet mot desinfeksjon. Vi har også identifisert en tredje type fibre som vi forventer å karakterisere og publisere funnene fra i 2025. Disse studiene vil bidra til vår forståelse av hvordan vi kan bekjempe B. cereus i industrien og samtidig åpne nye muligheter for å kontrollere bakterielle infeksjoner i medisinske sammenhenger. ENA fibrene hkan også gi inspirasjon til utvikling av nye motstandsdyktige materialer. Forskningen vår på ENA-fibre gir oss et unikt innblikk i B. cereus' evne til å overleve, tilpasse seg og spre seg i ulike miljøer. Dette er ikke bare en akademisk interesse – det har praktiske konsekvenser for hvordan vi kan forbedre mattrygghet, beskytte mot bakterieinfeksjoner, og i fremtiden kanskje til og med utvikle nye metoder for å forhindre kontaminering på tvers av flere bransjer. Vi er fortsatt i utforskningens tidlige faser, men resultatene vi har oppnådd hittil, viser at vi er på rett vei.

Bacillus cereus sensu lato (s.l.) is a large group of bacteria whose endospores are of food safety, industrial, medical and biodefense importance. Their endospores are decorated with multiple micrometres-long, a few nanometres wide fibers (endospore appendages (Enas)). The team behind this proposal has recently forced a major breakthrough by identifying the protein subunits that build the Enas and the genes encoding them. Notably, they represent a completely novel type of proteinaceous nanofibers, with unique structural properties and self-assembly mechanisms, that have never been described before. They are the third type of pili ever described in Gram-positive species and the first spore pili that have ever been structurally and genetically characterized. We have so far identified two major structural types of Enas that are widely distributed among species belonging to the large B. cereus group of bacteria. The SPORE NANOFIBER will use state-of the art cryo-EM, lazer-tweezer technology, 3D-modelling, gene-knockouts, recombinant genes, various functional analyses and an insect larvae infection model to generate knowlede on Enas composition, 3D structure, assembly mechanisms and biophysiochemical and mechanical properties. We will examine the role of Enas in various spore-related functions such as colonization of abiotic surfaces and biofilm formation as well as in spore binding to intestinal mucosal surfaces of humans, animals and insect larvae. The Enas are also of high interest for bio-nanotechnology as they are highly flexible, exhibit an extreme heat-, chemical- and enzymatic resistance, and can be produced in large quantities in vitro. This project has a great potential to generate knowledge that can be used to invent more efficient strategies to prevent or reduce spore attachment-related problems in the food industry and in medicine. Altogether, the proposed project fits well with the call for proposal for “Project for Scientific Renewal”.