Novel microbes for high level production of the omega3-fatty acid DHA and astaxanthin from biomass feedstocks

Thraustochytrider er marine, eukaryote mikroorganismer, der noen arter produserer høye nivåer av den marine omega3-fettsyren DHA. I tidligere samarbeidsprosjekter ved SINTEF og NTNU innen bioprospektering ble det etablert en samling av thraustochytrider. Blant disse ble det identifisert stammer som akkumulerer mer enn 60% fett av celletørrvekt, og hvor DHA utgjorde mer enn 30% av det totale fettinnholdet. Enkelte av stammene produserte dessuten karotenoidet astaxanthin. Både DHA og astaxanthin er viktige ingredienser i laksefôr. Å kunne produsere disse mikrobielt har således stor kommersiell interesse. Målsettingen med ThraustoEng-prosjektet var å etablere kunnskap og teknologi for å kunne benytte og forbedre thraustochytrider som biokjemiske cellefabrikker for produksjon av DHA og astaxanthin fra bærekraftige råmaterialer. Ved prosjektets start var ingen genomsekvenser for thraustochytrider publisert, og metoder for genoverføring og rekombinant arbeid var svært underutviklet. Derfor var utvikling av genetiske verktøy, genomsekvensering og fysiologiske studier sentrale mål og aktiviteter i prosjektet, for å etablere en solid kunnskaps- og metodebase for disse organismene, i tillegg til stammeutvikling for med henblikk på de kommersielle anvendelsene. Basert på god DHA-produktivitet og astaxanthin-innhold ble to stammer, Aurantiochytrium sp. S61 and T66, utvalgt for genomsekvensering. De oppnådde genomsekvensene utgjør henholdsvis 40 and 44 mill. basepar. Analyser av genuttrykk (transkriptomanalyser) ved dyrking av T66 under forskjellige betingelser ble benyttet som hjelp til identifisering av genene (annotering). Ved hjelp av disse metodene ble det identifisert ca 12 000 gener for hver av de to stammene. Ca. 50% av genene kunne plasseres i cellens metabolske nettverk basert på funksjon, mens ca. 22% av genene ikke er beskrevet tidligere i litteraturen. Sammen med tilgjengelige transkriptomdata, og fysiologiske data generert i fermenteringsstudier, har de annoterte genomsekvensene gitt ny innsikt i sammenhengen mellom genetikk, fysiologi og metabolisme, som muliggjør systematisk og målrettet metabolic engineering av thraustochytrider. Metoder for genoverføring og genetiske verktøy har vært lite utviklet for thraustochytrider. Fordi svært få tidligere arbeid var publisert, var det forventet at det ville bli krevende å få metodene på plass. I prosjektet har vi klart å etablere protokoller for genoverføring til stamme T66 ved både konjugering og elektroporering, og homolog rekombinering er demonstrert. Nye genkonstrukter for å øke uttrykket av utvalgte gener er laget. Som en alternativ metode til rekombinant DNA teknologi for stammeforbedring, kan målrettet evolusjon benyttes. En slik metode har den fordelen at det ikke kreves kunnskap om hvilke gener som er involvert, og utfra responsene kan en identifisere gener som bidrar til forbedrede egenskaper. Mutantbiblioteker er etablert, og nye, high-throughput, miniatyriserte og robotiserte analysemetoder som er utviklet i prosjektet, benyttes for karakterisering av mutantene.

Fish as food for human consumption is associated with health benefits, and one reason for this is the high content of omega3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs), which originates from the feed. For the fish farming industry it is therefore of critical imp ortance to have access to sufficient quantities of these compounds, in particular DHA. There are several options for solving the problem, but most of them face serious economic or technical obstacles. Here we propose to study a group of heterotrophic micr oalgae, the thraustochytrids, which we believe represents currently the most realistic DHA source for the fish farming industry. Thraustochytrids are already used for production of PUFAs with a very high efficiency for direct human consumption. As a sourc e for fish feed the main problem is that the relative DHA content must be significantly increased, and here we propose innovative ways to achieve this in strains that simultaneously produce the important feed additive pigment astaxanthin. The main scienti fic challenge is that the basic understanding of the thraustochytrid biology is very limited, as for example not even genome sequences have been reported. This is obviously no longer a technical problem to overcome, so we propose that the timing is now ri ght to establish genome sequences and use 'omics technologies to obtain a detailed understanding of PUFA and carotenoid biosynthesis. Gene modification technologies are to some extent available and we will expand the potential of such methods. Evolutionar y engineering will be used to select strains with the desired phenotypes from a library of randomly distributed mutants, and inverse metabolic engineering will be used to characterize the identified mutations. Various carbon sources can be used for cultiv ation of thraustochytrids, and in this project we will investigate the potential of using raw materials that are available in large quantities, and that originate from agriculture or marine sea-weeds.