Tetrahydrobiopterin as a key factor in the pathophysiology of diving

MSc Ronja Hesthammer tiltrådte som stipendiat ved Norsk Senter for Dykkemedisin, Yrkesmedisinsk avdeling, Haukeland Universitetssjukehus 1.09.2014. Opplæringsdel: Grunnkurs i medisinsk og helsefaglig forskning (MEDMET 1, UiB) ble gjennomført vinter 2015, kurs i Hyperbar fysiologi (MEDT 8013, NTNU) vår 2015, Medisinsk statistikk Del 2 ( KLMED 8005, NTNU) ble gjennomført vår 2016. I tillegg har hun deltatt på 5 dagers skrivekurs for PhD-stipendiater ved UiB (11-15.09.2017). Stipendiaten har hatt foredrag på årskonferansen til European Underwater and Baromedical Society i Genève, 13-16.09.2016, foredrag på Norsk Baromedisinsk Forening i Bergen 30.09.2016, foredrag på Norsk Biokjemisk Selskaps kontaktmøte, Hafjell, 18-21.01.2018 og posterpresentasjon på 10th International Conference on the Biology, Chemistry and Therapeutic Applications of Nitric Oxide, Oxford, UK, 16. ? 20.09.2018. Forskningsarbeid: Stipendiaten har fått opplæring i sterilarbeid ved hyperbart cellekulturlaboratorium, analytiske metoder ved Klinisk institutt 2 og respirasjonsfysiologiske metoder ved lungeavdelingen. Måling av kofaktoren tetrahydrobiopterin (BH4) og de oksiderte produktene dihydrobiopterin (BH2) og biopterin (B) ved bruk av høytrykksvæskekromatografi og massespektrometri (LC-MS/MS) omfatter komplisert instrumentering og krever betydelig erfaringsgrunnlag for tolkning av data. Hun har etablert metode for aktivitetsmåling av enzymet som produserer signalmolekylet nitrogen oksid (NO) i blodkarceller ved bruk av radioaktivt merket arginin. Etter opplæring har stipendiaten arbeidet selvstendig med alle metodene. I en human studie ble 15 forsøkspersoner eksponert for 100 % O2. Før og etter eksponering ble det målt NO i utpust (FENO) og BH4 og fenylalanin (Phe) i blodprøver. Studien var i forkant godkjent av Regional etisk komité (REK). En pilotstudie på pasienter under hyperbar oksygenbehandling ble ikke gjennomført pga få egnede pasienter. Optimalt måletidspunkt etter eksponering ble valgt på bakgrunn av data fra tidligere studier og nye data fra 3 friske forsøkspersoner eksponert for 100 % oksygen i 90 min. Resultatene antydet avtagende BH4 60 min. etter eksponering, og dette ble valgt som standard måletidspunkt. I noen tilfeller ble NO målt både etter 30 min og 60 min. Resultatene tydet på en forbigående nedgang i FENO og retur til basalnivået 60 min. etter eksponering. Fordi nedgangen i NO kom tidligere enn forventet ble det utført en oppfølgingsstudie med 13 nye personer der NO og BH4 ble målt umiddelbart etter eksponering. Samlet viste studiene nedgang i BH4 og FENO på hhv 14 og 12 % og støtter dermed hypotesen om at høyt oksygennivå oksiderer BH4 og fører til mindre NO-dannelse. Resultatene er bearbeidet til en vitenskapelig artikkel og sendt til vurdering i et vitenskapelig tidsskrift. Resten av forskningsarbeidet er utført ved bruk av en cellemodell der humane blodkarceller er eksponert for økt oksygenpartialtrykk, og økt totaltrykk i trykkammer. Innhold av BH4 og dannelse av NO ble målt i cellene etter eksponering. BH4-nivået gikk ned med økende O2-konsentrasjon, sannsynligvis pga oksidasjon av BH4. Målingene av den oksiderte formen BH2 gjenspeilte ikke dette, noe som kan tyde på dannelse av andre produkter enn BH2. Dannelsen av NO ble påvirket i mindre grad, og var ikke doseavhengig. Simulert dykking med høyt totaltrykk hadde liten eller ingen tilleggseffekt på BH4, men senket NO-produksjonen tilsvarende som ved hyperoksi. Askorbinsyre (C-vitamin) ble tilsatt kulturmediet for å sikre et tilstrekkelig nivå av BH4. Uten tilsatt askorbinsyre var BH4 under 14 % av nivået med askorbinsyre, og enda lavere etter O2-eksponering, mens NO-produksjonen ble påvirket i liten grad. Når det intracellulære nivået av antioksidanten glutation (GSH) ble senket til under 2 % av kontroll hadde det liten eller ingen effekt på BH4 og påvirket heller ikke NO-produksjonen. Det kan tyde på at andre antioksidanter er viktige for å hindre oksidasjon av BH4. Data fra samtlige celleforsøk ble benyttet for å undersøke sammenhengen mellom den intracellulære konsentrasjonen av BH4 og NO- produksjonen, men ingen korrelasjon ble funnet. Dette indikerer både at nivået av BH4 som er nødvendig for å opprettholde NO-dannelsen i cellene er lavere enn tidligere antatt og at senkning av BH4-nivået enten som følge av hyperoksieksponering eller mangel på antioksidant ikke medfører en tilsvarende nedgang i NO-produksjonen. Resultatene tyder på en kompleks sammenheng mellom BH4-nivået og NO-produksjon i humane blodkarceller. Resultatene fra celleforsøkene er sammenfattet i to artikler som er akseptert for publisering i tidsskriftet Undersea and Hyperbaric Medicine og inngår i avhandlingen "Tetrahydrobiopterin and nitric oxide synthesis after exposure to hyperoxia and simulated diving. An experimental study in human endothelial cells and healthy humans". Den ble levert til Universitetet i Bergen 27.06.2019 med anmodning om bedømmelse for PhD-graden.

Hovedmålsettingen med prosjektet har vært å undersøke biokjemiske mekanismer som kan ha betydning for utvikling av trykkfallsyke ved dykking. Resultatene tyder på at den biokjemiske kofaktoren tetrahydrobiopterin som er nødvendig for produksjonen av signalmolekylet nitrogenoksid delvis ødelegges under betingelser som tilsvarer det man har ved dykking, men at det er mindre sannsynlig at det medfører de negative konsekvensene for sirkulasjonssystemet man kunne frykte. Det gjenstår imidlertid noe arbeid for å bekrefte at funnene som er gjort med isolerte blodkarceller også gjelder for det vaskulære systemet hos mennesker. Resultatene bidrar til å øke kunnskapsnivået innen dykkefysiologi og hever kompetansenivået hos de involverte fagmiljøene. Det bidrar også til økt forståelse av biokjemiske signalveier i det vaskulære systemet generelt, og er derfor nyttig kunnskap også for dem som arbeider med funksjonalitet til blodkar uavhengig av dykking.

Saturation diving is an efficient intervention method in the offshore petroleum industry, but an occupational activity under extreme environmental conditions. The main objective of the present project is to increase the knowledge of health effects of divi ng and how adverse effects can be prevented. Small signal molecules like nitric oxide (NO) play an important role in the regulation of cardiovascular function and small vessel functionality. The generation of NO in blood vessels and the dependence of crit ical cofactors like tetrahydrobiopterin (BH4) are assumed to be key points in several disease states of the circulatory system. The functionality of blood vessels is important to avoid injury during decompression in diving. BH4 is prone to oxidation and r ecent findings have indicated that high oxygen level decreases both BH4 and NO generation. Since elevated oxygen level is an inevitable part of diving the present project aims to elucidate the role of the signalling molecule NO in relation to diving, with particular focus on BH4. Revealing the underlying mechanisms of blood vessel functionality and decompression injury is a prerequisite for remedial actions, e.g. pharmacological or physiological intervention to protect BH4 from oxidation and maintain the cofactor level, providing divers with an improved resistance against their extreme working environment. Both isolated human blood vessel cells and human volunteers will be used to investigate the effect of high oxygen level and the influence of antioxida nts on the cofactor BH4 and NO-generation. The human study may reveal whether our previous observation of decreased NO concentration in exhaled gas after exposure to high oxygen concentration is related to oxidation of BH4 by determination of the cofactor in blood. The human study may thus extend and possibly confirm the findings from the cell model. Graduation of a PhD student also fulfils the important aim of scientific recruitment.