KryoBeg - Elimination of endophytes and cryoperservation of begonia

I dette prosjektet har vi lyktes med å både 1) identifisering av endogene bakterier(endofytter) i begonia-vevskultur, 2) etablere kryopreservering av begonia, 3) etablert forbedrede metoder for desinfisering og rensing av begonia, og 4) skaffet oss erfaring med CRISPR/Cas9 i begonia. Vi har funnet at endofytter påvirker vevskulturer negativt, men at disse bakteriene ikke gir skadelige effekter på vekst og utvikling når plantene vokser på jord. I alt 27 sorter har blitt renset for bakterier som er ugunstige for vevskultur og kryopreservering. Dette prosjektet har hatt stor verdi for Tiboplant i arbeidet med rent materiale som utgangspunkt for oppformering av morplanter. Rensingen for endofytter og kompetanse på effekter er viktig overfor samarbeidene laboratorier i Europa. Kryopreservering viser seg å være en reell mulighet som Tiboplant fortløpende vurderer, og også vil kunne tilby samarbeidspartnere. Prosjektet har bidratt til at norsk blomsternæring fortsatt kan hevde seg på det internasjonale markedet og sikret gode rutiner for utveksling av friskt plantemateriale mellom landene. Prosjektet har gitt et godt og nært samarbeid mellom FoU-institusjoner og næringslivet. Prosjektets hovedmål var å sørge for at hele foredlingsprogrammet innen begonia er basert på friskt plantemateriale, fritt for endofytter, samtidig som foredlingslinjene og sortene holdes stabile og sortsekte. Dette er avgjørende for TiboPlant sin videre utvikling i markedet. Prosjektet har brukt moderne teknologi for å identifisere endofytter, og har også utviklet gode rense- og bekjempelsesmetoder. Foredlere er ansvarlige for å holde et sortsekte morplantemateriale av sine sorter. TiboPlant har ønsket å utvikle kryopreservering for å løse denne viktige oppgaven. Prosjektet har vært organisert med fire arbeidspakker: 1) eliminering av endofytter i vevskultur av begonia; 2) kryopreservering for langtids-oppbevaring av verdifulle sorter; 3) utprøving av sortsmateriale for å undersøke sortsekthet; og 4) undersøke begonia for patogener og endofytter ved hjelp av ny diagnosemetodikk (metagenomics). Prosjektet har blitt utført etter prosjektplanen. Bakterieisolater fra vevskulturer av alle 32 begoniasortene har blitt analysert med 16S-sekvensering av bakterie-nukleinsyre. I alt 18 begoniasorter var infisert med én eller flere av syv forskjellige bakteriearter. I alt 11 gamle sorter og 3 nye sorter var fri for bakterier. Noen av bakterieisolatene har blitt identifisert til å være artene Curtobacterium flaccumfaciens, Agrobacterium radiobacter, og Cellulomonas flavigena. Metagenomics-forsøk har blitt gjort med 8 utvalgt begoniasorter og vist at epifyttiske bakterier er mest vanlig i vevskulturer, det vil si bakterier som lever på bladoverflaten uten å forårsake plantesykdommer. I tillegg ble det funnet stor variasjon av bakteriearter i 'Sky White', en sort som så ut til å være uten infeksjon ved testing med andre tradisjonelle metoder. Vi har også undersøkt virkningen av forskjellig antibiotika, der både cefotaxime, chloramphenicol, Rifampicin og Streptomycin har blitt prøvd ut. Gjentatte forsøk har vist at Rifampicin virket best mot bakterieslektene vi har funnet i begonia. Kombinert bruk av mer effektiv overflatedesinfeksjon og antibiotika har ført til en rensing av i alt 27 begonia sorter og foredlingslinjer slik at disse har blitt etablert som bakteriefrie vevskulturer i løpet av prosjektperioden. Kryopreservering med droplet-vitrification metodikk har blitt optimalisert. En forbehandling med bruk av PVS3 i en 120 min behandlingstid ga det høyeste antallet overlevende skudd (ca 40%) etter kryopreservering for sorten 'Sky White'. Vi har testet kryometoden på foredlingslinjene 'City Pink', 'Bicolor Apricot', 'Urban Sweet Peach' and 'Sun Red'. Overlevelse etter kryopreservering varierte fra 0% til 40%. Foredlingslinjen Urban 'Sweet Peach' (B67) infisert med endofytter overlevde ikke kryopreservering i det hele tatt. Tre gartnerier var involvert i veksthusforsøk i prosjektperioden. Vi undersøkte virkningen av endofytter, kryopreservering og antibiotikabehandling på vekst og utvikling. Flere faktorer ble registrert, blant annet tid til første åpne blomst, plantehøyde, plantediameter og totalt antall blomster. Det ble ikke funnet noen skadelig virkning av endofytter og antibiotikabehandling i veksthusdyrking. Det var imidlertid en mulig ettervirkning av kryopreservering der behandlet plantemateriale vokste mer og hadde flere blomster. Resultater fra hele prosjektperioden har blitt bearbeidet med tanke på vitenskapelig publisering. Prosjektets hjemmeside hos NIBIO: https://www.nibio.no/prosjekter/kryobeg--eliminering-av-endofytter-og-kryopreservering-av-begonia?locationfilter=true

Prosjektet har bidratt til at norsk blomsternæring fortsatt kan hevde seg på det internasjonale markedet og sikret gode rutiner for utveksling av friskt plantemateriale mellom landene. Viser til vår populærvitenskaplige sluttrapport for mer detaljerte resultater

Begonias are economically important ornamentals for outdoor decoration as bedding or patio plant all over the world. TiboPlant is a new Norwegian company focusing on begonia breeding for the domestic and international market. It is recognized on the global flower market for novelties of begonias due to several valuable cultivars released the past three years. The main challenges today are the presence of endophytes in the clones, and the maintenance of an increasing number of promising new breeding lines. The main goal of this project is to keep the entire breeding program of begonias clean, genetically stable and secure, which is crucial for TiboPlant?s market development and to benefit the expansion of the Norwegian flower industry in due course. The endophytes cause trouble in the shipment and laboratory propagation of novel cultivars. Maintaining true-to-type plant material is crucial for any owner of varieties for the international market. Cryo-preservation is needed for this task. The use of modern technologies to secure rapid identification of endophytes will be developed. To reach the main goal and solve some of the issues at stake, we have four work packages: 1) elimination of endophytes in begonia tissue cultures; 2) cryopreservation for long-term storage of valuable cultivars; 3) true-to-type evaluation; and 4) screening of begonia pathogens and endophytes by metagenomics analysis. This project will enable NIBIO and NMBU in serving the Norwegian plant production with competence and knowledge for production and preservation. Furthermore, the project will aid Ljones Gartneri, Strand Gartneri, Ingvoldstad Gartneri and Hoels Gartneri in reaching the full potential for the begonia-breeding program together with TiboPlant. This project will also directly help Statens fagskole for gartnere og blomsterdekoratører to develop students? training in close collaboration with the greenhouse industry and research/higher education institutions.