Microbial contributions to the Atlantic salmon (Salmo salar) skin mucosal barrier

Fisk lever tett på bakterier; i sjøvann er det rundt én million av dem per milliliter. Fisken skiller ut et slim (mucus) som dekker skinnet, og dette slimlaget danner sammen med skinnet en barriere som beskytter fisken mot bakterier og andre stoffer i vannet. Men i slimlaget finnes det imidlertid også bakterier som ser ut til å være en naturlig del av fiskens skinnoverflate. Hvorvidt disse bakteriene er til nytte for fisken, er ikke kjent. Slimlaget på fiskeskinn har store likheter med slimlaget som dekker tarmveggen hos virveldyr og mennesker. Også tarmveggen er bebodd av bakterier, og ny forskning viser at paradoksalt nok, er disse bakteriene nødvendige for å oppnå beskyttelse mot andre bakterier. Vår hypotese er de naturlige bakteriesamfunnene (mikrobiotaen) i fiskeskinn er nødvendige for at også dette slimlaget skal fungere som en barriere. I dette prosjektet brukte vi en tverrfaglig tilnærming for å undersøke hvordan bakterier påvirker slimhinna på skinnet til plommesekkyngel av laks. En viktig milepæl var utviklingen av en metode for å dyrke bakteriefrie plommesekkyngel. Sammenliknende analyser av bakteriefrie fisk med fisk som har vært utsatt for normale mikrobielle omgivelser, kan gi svar på hvordan bakterier påvirker denne slimbarrieren. Modellsystemet vårt gjør det også mulig å studere egenskapene til mucus på en intakt, naturlig slimhinne. Ved hjelp av reologiske analyser fant vi at skinnmucus hos plommesekkyngelen er en lagdelt og heterogen struktur. Mens ett sjikt er fast og tett assosiert med skinnet, består et utenforliggende lag av mucus som er mer viskøst og løsere assosiert med fisken. Dette løsere slimet skilles raskt ut, og våre resultater viser at dette kan være en mekanisme for å fjerne skadelige partikler fra skinnoverflata. Vi fant også at det faste mucuslaget blir tjukkere, og det løse slimet sterkere, utover i plommesekkfasen. Videre undersøkte vi hvordan denne slimoverflata ble påvirket av bakterier. Ved hjelp av reologi, refleksjonsmikroskopi og AFM (Atomic Force Microscopy)-analyser fant vi at det faste slimlaget hos bakteriefrie yngel er tynnere, og at det løse slimet har endrede viskoelastiske egenskaper og er svakere, enn hos normal yngel som har vært utsatt for bakterier. Den naturlige fiskemikrobiotaen er altså med på å forme barriereegenskapene til skinnslimlaget. Resultatene tyder på at også sammensetningen av mikrobiotaen har betydning for disse effektene. Vi fant indikasjoner på noen bakteriesamfunn også kunne virke inn på tjukkelsen av selve huden (epidermis). Tilstedeværelse av bakterier påvirket ikke det totale antallet av slimproduserende gobletceller, men vi observerte en økt andel aktive celler som skilte ut slim i nærvær av visse bakteriesamfunn. Tilstedeværelsen av bakterier påvirket også genuttrykket i skinnet: Uttrykket av to gener som koder for antimikrobielle peptider (små proteiner som er en del av fiskens beskyttelse mot bakterier) økte signifikant, og vi observerte også en liten økning i uttrykket fra gener som koder for muciner; hovedbestanddelen i slimlaget. Ved hjelp av AFM fant vi at to patogene bakteriestammer; Yersinia ruckeri og Aeromonas salmonicida, bandt seg til muciner som var isolert fra lakseskinn og -tarm. A. salmonicida bandt seg sterkere til skinn- enn til tarm-muciner. Derimot fant vi ingen binding mellom disse bakteriene og intakte skinnoverflater på yngel. Dette kan skyldes at det løse slimet ytterst på skinnoverflata har væskeliknende egenskaper, og at bakterier som fester seg i dette slimet raskt fjernes sammen med slimet som skilles ut. Vi karakteriserte skinnmikrobiotaen hos plommesekkyngel som var eksponert for ulike bakteriekilder. Den var svært forskjellige fra bakteriesamfunnene i vannet, men likevel ble de påvirket av det mikrobielle miljøet yngelen ble klekket og dyrket i. Skinnmikrobiotaens sammensetning varierte mellom individer, og endret seg med fiskens alder. I denne tidlige livsfasen, før fisken har startet aktiv spising, var det ingen stor forskjell mellom skinn- og tarm-mikrobiota hos ett og samme individ. Skinnmikrobiotaen var motstandsdyktig mot manipulering og yngelen var motstandsdyktig mot bakteriesykdom: Vi eksponerte fisken for store doser av ikke-patogene Janthinobacterium-isolater og sykdomsbakterien Yersinia ruckeri, uten at sammensetningen av fiskens mikrobiota endret seg nevneverdig, og uten av fisken ble syk. Dette prosjektet har vist at slimhinna som dekker hudoverflaten til plommesekkyngel av laks er heterogen og kompleks. Bakterier er nødvendige for å oppnå full barrierefunksjon og påvirker denne slimhinna på mange nivå; tykkelse og viskoelastiske egenskaper av slimet, aktiviteten til mucus-produserende celler i epidermis, og uttrykket gener som koder for antimikrobielle peptider. Skinnmikrobiotaen viste seg å ha høy diversitet, den varierte mellom individer og endret seg med alderen. Den var motstandsdyktig mot eksponering for høye doser av både en patogen og en ikke-patogen bakteriestamme.

The project brought new, valuable knowledge about the skin mucosa of Atlantic salmon fry, the skin microbiota, and the microbial influence on this mucosal barrier. This contributed to move forward the knowledge status in the field of host-microbe interactions on mucosal surfaces. The development of a new model system based on germfree salmon fry, and the implementation of analytical methods rarely used to study host-microbe interactions, will be important for developing new basic and applied research projects. On a longer term, the results obtained in this project will may contribute to promote mucosal health and microbial management in the aquaculture industry. A total of 14 master students did their research projects directly in relation to this project. A PhD candidate funded by the project is expected to complete her thesis in near future. The project contributed to interdisciplinary collaboration and developed and expanded the competence of all researchers involved in the project.

In the proposed project, we will investigate the role of fish skin microbiota in the mucosal barrier function for Atlantic salmon. Fish live in close contact with bacteria, and their skin mucosa is colonized by a distinctive microbiota. Fish skin represents an ancient vertebrate mucosal surface sharing functional and structural characteristics with the intestinal mucosa. While the importance of the gut microbiota to the mucosal barrier function is increasingly recognized, the role of the fish skin microbiota is not known. We hypothesize that the commensal microbiota colonizing fish skin mucosa is essential for obtaining full barrier function. In this project we will examine microbial effects on various aspects of the skin mucus barrier function in salmon fry. To achieve this, we will use a highly multidisciplinary approach, including national and international experts from divergent research fields. The project involves establishment of a germ-free model for salmon fry, allowing for examining well-defined, controlled microbial conditions. The potential effects of different microbial conditions on the mucosal barrier will be addressed at several levels: A) At the molecular level, using ultra-sensitive force probe (Atomic Force Microscopy; AFM) to study adhesion properties and bacteria-mucins interactions. B) Mucus barrier properties (mechanical, interactive, immunological) using micro-rheology (Multiple Particle Tracking), AFM, and gene expression analysis of immune factors. C) Finally, the barrier function will be tested by introducing fish pathogens to fry and mucus (Obj.4). A new approach here is to study intact natural mucosal surfaces by these high-resolution techniques. The project is expected to provide new basic insight in mucus-microbe interactions on mucosal surfaces, about barrier properties of fish skin mucosa and the role of the commensal microbiota. Improved understanding the skin barrier function is highly relevant to aquaculture of Atlantic salmon.