Branching Out: Unravelling the Molecular Control of Communication

Prosjektet undersøkte molekylære mekanismer som regulerer cellekommunikasjon under forgrening i modellarten hybrid asp (Populus tremula x P. tremuloides). Mens hormoner regulerer meristemfysiologi, integrerer cellekommunikasjon meristemaktiviteter. Sideknopper ved skuddspissen og utvikler seg gradvis til modenhet før de går inn i en inaktiv tilstand. Aktivering resulterer i grendannelse, som kan undersøkes eksperimentelt ved å fjerne skuddspissen. Det er omstridt om hormonet gibberellin (GA) fremmer eller hemmer forgrening. For å løse dette gjennomførte vi en omfattende GA-transkripsjons- og metabolittanalyser. Vi oppdaget at forskjellige GA-arter, GA3/6 og GA1/4, fungerer i rekkefølge for å hemme og fremme forgrening. Disse motstridende effektene er basert på den avgjørende funksjonen at GA-kataboliserende GA2oxidase-enzymer retter seg mot GA1/4, men ikke GA3/6. Våre metabolittanalyser viste at inaktive knopper hadde et høyt nivå av GA3/6 og GA2oxidase transkripsjoner, noe som førte til den eksklusive nedbrytningen av GA1 /4. Eksperimentell knoppaktivering nedregulert ekspresjon av GA20oxidase-gener, lettet GA1/4-katabolisme og oppregulerer GA1/4-biosyntesegener. Kort sagt GA3/6 i knoppene holder GA1/4 nivåer lave og forhindrer knopputvekst, mens knoppaktivering nedregulerer GA-kataboliserende enzymer og fremmer GA1/4 signalering og forgrening. Under knoppdannelse akkumuleres lipidlegemer (LB), som lagrer nøytrale lipider for å støtte fremtidig vekst. LBs ekstraheres fra det endoplasmatiske retikulum av OLEOSIN-proteiner. LB kan rekruttere cytoplasmatiske proteiner og målrette plasmodesmata, kommunikasjonskanaler mellom meristemceller som integrerer meristemfunksjon. Vi undersøkte LB-produksjon, og analyserte LB-proteomet fra LB-er isolert fra modne knopper. Vi oppdaget at OLEOSIN6 det viktigste genet for LB-produksjonen. For å studere LB-transport transformerte vi genetisk Arabidopsis med OLEOSIN6 merket med fluorescerende eGFP (OLE6-eGFP). Vi viste at LB bevegelse ikke skyldtes cytoplasmatisk bulkbevegelse, men at LB-OLE6-eGFP når plasmodesmata via aktin, motorisert av myosin XIs motorproteiner. Farmakologisk hemming av aktin-myosin transportmekanismen arrestert LB bevegelse. Videre, i en trippel myosin-XI knockout-mutant (xi-k / 1/2), transformert med PtOLE6-eGFP, ble transport av LB sterkt svekket. Sammen bekreftet dette at LB-bevegelse krever myosin XIs motorproteiner. Vi undersøkte LB-produksjon, isolerte LB-er fra modne knopper og analyserte LB-proteomet. Vi fant at den dominerende OLEOSIN, OLE6, ble fjernet fra LBs før knoppmodning, noe som resulterte i LBs utvidelse. Dataene indikerte at OLEOSINs ble fjernet av en nedbrytningsmekanisme sammensatt av PUX10, CDC48A, UBP-proteiner og 26S-proteasomet, og erstattet av cytoplasmisk rekrutterte LDIP- og LDAP-proteiner av de forstørrede LB-ene. Redusert molekylær trengsel ved forstørrede LB-overflater resulterte i et utvidet LB-proteomet. LB-proteomet også inneholdt myosin XI-hale-bindende RAB-ATPase som binder LB til myosin XI-aktin forsamlingen, muliggjør bevegelse på aktin. Vi fant ut at denne RAB-ATPase lokaliseres til eGFP-merkede LB-er. Proteomet inneholdt mange proteiner som tidligere er funnet ved LB eller plasmodesmata. RNA-sekvensering identifiserte hormonelle faktorer som er tidlige respondenter til knopper aktivering. Hormonene, strigolakton (SL) og GA regulerer sammen forgrening. Selv om SL blir sett på som en grenhemmere, er det i hybrid aspen ikke effektivt å holde sideknoppene inaktive. Knoppaktivering formidles av GA4 og krever tidlig nedregulering av GA-nedbrytningsgener. I motsetning til konsensusoppfatningen om at auxin, SL, cytokininer og abscisinsyre er de relevante forgreningshormonene, resultatene våre demonstrerer GAs fremtredende rolle. Illumina RNA-sekvensering på genomnivået, kombinert med analyser av differensialgenekspresjon av gener involvert i biosyntese og nedbrytning av de ovennevnte hormonene, bekrefter at GA har en nøkkelrolle i å fremme knoppaktivering, mens SL og ABA opprettholder inhibering i inaktive knopper. Trær viser forskjellige forgreningsstiler, referert til som sylptisk og proleptisk. I sylptiske trær produserer de unge sideknoppene grener i samme sesong, men i proleptiske trær som hybrid aspen modne sideknopper gir grener etter passering gjennom dvalen. Ved hjelp av en rekke metoder fant vi at ABA nedregulerer et viktig GA-biosyntese gen som er nødvendig for forgrening. Syllepsis korrelerer med akkumulering av reserver som lipidlegemer, endogene ABA-nivåer og ekspresjon av greninhibitorgenet BRC1 og 1,3-beta-glukanasegener som gjenoppretter kommunikasjon mellom stamme og knopper. Til sammen indikerer prosjektresultatene at ABA / GA-forholdet i inaktive sideknopper bestemmer forgreningsstilen ved å kontrollere stamme-knopp-kommunikasjonsveiene gjennom produksjon av LB-er og rekruttering av LB-proteiner.

The results from this project are a breakthrough in branching research, foremost scientifically as they integrate hormonal, and molecular mechanisms with cellular infrastructure and cell-cell communication and transport. As the project results provide insight into fundamental processes that govern the design of plants, we believe that the work will significantly promote the research field of plant development. The current and the previous projects have trained postdoctoral workers, but unfortunately due to existing national policies the opportunity to maximize return on investment by recruitment of these competent researchers is frustrated.

The proposed approach will contribute to solving one of the most fundamental problems in plant development: 'how do plants regulate shoot architecture' As the number of branches determines quantity and quality of the produce, finding answers will not only benefit production through improved culture practices, but also open up new avenues for breeding and genetic improvement of plants for food production and biofuel industries. The single key event in architectural development, even in a tree, is the activation and outgrowth of axillary buds. The set of known branching hormones auxin and cytokinin was recently expanded to include strigolactone, a hormone that inhibits bud activation by hampering auxin export. Despite this progress, a comprehensive model remains absent. The present project will overcome this be taking a completely novel approach. In this 'plumbers view' the effectiveness of signals to trigger branching depends on the functionality of conduits that bring the signals to their target. We propose that, to form a branch, a bud must establish a functional connection with the stem through plasmodesmata, tiny signal conduits between cells, and sieve tubes, which deliver materials for growth. In addition, we introduce the unorthodox idea that gibberellin is the fourth branching hormone, and that it functions in opening the communication channels, while strigolactone inhibits communication and transport between stem and bud. We are well placed to carry out this work. We pioneered research into plasmodesmata, and identified with collaborators at Helsinki University a class of hormone-regulated genes that control plasmodesmata. Our work is internationally at the forefront, influential, and highly cited, whereas our collaborators at Wageningen University are world leaders in strigolactone research. The project will renew branching-research, and contribute to Norway's national knowledge base to meet future challenges.