FRIPRO-Fri prosjektstøtte

Hvordan organismer kan overleve og trives i miljøer som vanligvis ikke anses for å være kompatible med liv, for eksempel temperaturer over kokepunktet og under frysepunktet for vann, har vært utfordrende å forstå fullt ut. Gjennom millioner av år med tilpasning har organismer brukt ulike strategier for å overleve i så tøffe miljøer. Atomære og molekylære bevegelser reduseres betydelig rundt frysepunktet til vann, og hastigheten på kjemiske reaksjoner avtar eksponentielt når temperaturen senkes. Kuldetilpassede organismer kan motvirke dette ved å syntetisere spesialiserte enzym som katalyserer de kjemiske reaksjonene meget effektivt ved lave til moderate temperaturer. Hva gjør at disse enzymene kan fungere ved lave temperaturer der deres varmeaktive motstykker er inaktive? Sammenligning av den tredimensjonale strukturen til homologe enzymer ser ved første øyekast veldig lik ut, og det aktive stedet der den kjemiske reaksjonen finner sted er i de fleste tilfeller identisk. Forskjellen i biologisk aktivitet ser ut til å oppstå fra strukturelle forskjeller fjernt fra det aktive stedet. Hovedhypotesen som vi nå forfølges er at forskjellen i biologisk aktivitet mellom kalde- og varmeaktive enzymer skyldes en mykere proteinoverflate for enzymer som opererer ved lave temperaturer. En mykere overflate antas da å redusere mengden energi som kreves for å bringe reaktantene til produkter i reaksjonene katalysert av kaldaktive enzymer sammenlignet med deres varmaktive homologer. Flere enzymer fra nært beslektede organismer er valgt for å undersøke hovedhypotesen vår. Dette inkluderer så langt lipase, esterase, korismat mutase, amylase og endonuklease. Vi har etablert protokoller og systemer for å produsere og karakterisere disse enzymene i laboratoriet. Gjennom komparative studier hvor kuldeaktive enzymer sammenlignes med de varmeaktive motpartene, er det utført katalytisk aktivitet som funksjon av temperatur og følsomheten for termisk smelting. Videre er den tredimensjonale strukturen til flere av disse enzymene løst ved hjelp av røntgenkrystallografi, som er sentralt for videre studier med molekylære modelleringsteknikker. Kuldetilpassede enzymer kjennetegnes både av en høyere katalytisk aktivitet ved lave temperaturer og ved at deres temperaturoptimum er forskjøvet ned, sammenlignet med mesofile ortologer. I flere tilfeller faller optimum ikke sammen med temperaturen for begynnelsen av proteinsmelting, men reflekterer en annen type inaktivering. I den psykrofile a-amylasen fra en antarktisk bakterie antas inaktiveringen å stamme fra en spesifikk enzym-substrat interaksjon som brytes rundt romtemperatur. Vi har brukt beregningsteknikker for å redesigne dette enzymet med sikte på å skifte temperaturoptimal oppover. Et sett med mutasjoner designet for å stabilisere enzym-substrat-interaksjonen ble forutsagt av datasimuleringer av den katalytiske reaksjonen ved forskjellige temperaturer. Forutsigelsene ble verifisert av kinetiske eksperimenter og krystallstrukturer av den redesignede a-amylasen, som viser at temperaturoptimumet faktisk er markert forskjøvet oppover og at den kritiske overflatesløyfen som kontrollerer temperaturavhengigheten nærmer seg målkonformasjonen observert i en mesofil ortolog. Et interessant spørsmål å stille i denne sammenhengen er om naturen har utviklet noe som ligner på vårt designet enzym. Søking gjennom proteinsekvensdatabaser avslørte at vårt designet enzym er mest likt tilsvarende enzym fra varmetilpassede bakterier. Det ser dermed ut til at naturlig evolusjon kan ha fungert på samme måte som vår beregningsstrategi. Prosjektet fokuserte også på utvikling av programvare som senker terskelen for å anvende avanserte beregningsteknikker ved å bruke grafiske brukergrensesnitt for å sette opp, kjøre

Our planet has several environments that are potentially hostile to life. The survival of organisms has required the expression of proteins adapted to function under extreme temperature, pH, pressure and ionic strength. However, the origin of such adaptations is in most case still an open question. Faced with an exponential decrease in chemical reaction rates as the temperature is lowered, cold-adapted organisms require specialized enzymes to maintain a functional metabolism. Although often highly homologous to their mesophilic counterparts, these enzymes have some characteristic and universal properties that reflect their evolutionary optimization. Such enzymes catalyze their reactions with lower activation enthalpies counterbalanced by more negative entropies, yielding higher rates at low temperatures. The structural origin of the seemingly universal change in the activation enthalpy-entropy balance for cold-adapted enzymes remains very puzzling. The basic problem with connecting macroscopic thermodynamic quantities, such as and derived from experimental Arrhenius plots, to the 3D protein structure is that the underlying microscopic energetics is essentially inaccessible to experiment. Extensive computer simulations and calculated high-precision Arrhenius plots may now offer a solution to reveal the evolutionary principles involved in tuning the enthalpy-entropy balance. The interest in enzymes from extremophiles (extremozymes) from the viewpoint of industrial and biotechnological applications is also immense, as their potential use as biocatalysts may offer many advantages due to the fact that their activity is tailored for unusual environmental conditions. Such biocatalysts may either be exploited directly or be reengineered from orthologous mesophilic enzymes, given that the design principles of the desired biophysical properties are known.