HESTEFORSK Forståelse av etiologien bak acquired equine polyneuropathy via studier av Schwanske cellekulturer H-18-47-409

Det første året av prosjektet lyktes vi med delmål A og har nå dyrket Schwannske celler (SC) fra totalt 3 ikke-nevrologiske hester. Vi har totalt 83 millioner celler fra disse kontrollhestene nedfrosset i flytende nitrogen. Det ble prøvd ut litt ulike metoder for prøveuttak før vi fant en metode som muliggjør uttak og forsendelse fra felt. I september 2020 ble det avlivet en hest som hadde gjennomgått AEP i 2012. Nerveprøver undersøkt ved Ludwig-Maximilian universitetet bekreftet milde, kroniske forandringer samsvarende med tidligere rapporter på hester med gjennomgått AEP. Det ble også funnet en mulig, enkel inklusjon i SC. Det har tidligere ikke blitt påvist noen inklusjoner hos hester som har blitt avlivet mange år etter gjennomgått sykdom, men samtidig er funnet forbundet med noe usikkerhet og det er ikke sannsynlig at det lar seg gjenfinne i cellekulturer. Kultivering av SC var vellykket, og vi har 35 alikvoter à 1 million celler nedfrosset fra denne hesten. I september 2021 ble det avlivet en hest som hadde hatt AEP både i 2013 og 2018. Begge ganger hadde den milde symptomer og ble symptomfri etter noen måneder og ble nå avlivet pga halthet. Fra denne hesten har vi serum nedfrosset fra begge periodene med AEP, i tillegg til prøver fra grovfôret. Nerveprøver undersøkt ved Ludwig-Maximilian universitetet bekreftet mild, kronisk re- og demyeliniserende nevropati, forenlig med gjennomgått AEP. Det ble ikke funnet noen inklusjoner. Vi har også her fått god vekst av celler på laboratoriet, og er i ferd med å fryse dem ned. Cellesortering (delmål B) Blandingskulturer (Schwannske celler og fibroblaster) representerer en naturlig konstellasjon i nervene in vivo, men vi tror at enkelte forsøk er enklere å tolke med så rene kulturer som mulig. Noen uker før pandemien slo til i fjor hadde vi konkrete planer om å foreta fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) ved kjernefasiliteten ved Oslo Universitetssykehus, Ullevål. Dette ble avlyst, og sorteringen ble satt på vent. Veterinærhøgskolen har, etter flyttingen, anskaffet egen FACS-fasilitet, og bl.a. ved hjelp av denne vil vi i løpet av høsten forta en systematisk sortering av de kulturene vi har samlet inn så langt. Målet er å få frem så rene Schwanncellekulturer som mulig. Trigging av Schwanncelleskade (delmål C og D) Innledende forsøk med å tilsette serum fra friske og syke hester til kulturer fra friske og syke hester vil bli påbegynt i høst. Hypotesen er at serum fra syke hester inneholder elementer som kan påvirke de Schwannske cellene. En viktig markør for at cellene påvirkes vil være GRP78 BiP, et protein i RER som er assosiert med cellulært stress. I studier av cytoplasmatiske inklusjoner i SC (in situ) hos akutt AEP syke hester er det vist at inklusjonene er positive for dette proteinet. Vi har anskaffet et antistoff mot GRP78 BiP, og vil bruke dette til immunfluorescensstudier for eventuelt å påvise en økning av proteinet i SC som kultiveres med serum fra syke hester. Med vårt nye avanserte Leica Stellaris konfokalmikroskop, bl.a. utstyrt med «Lightning Superresolution»-funksjon med en oppløsning ned mot 120 nm, har vi håp om å kunne dokumentere eventuelle endringer i cellene. I tillegg til GRP78 BiP har vi et panel med antistoffer mot myelinmarkører som viser modningsgraden i de Schwannske cellene. I ustimulerte SC-kulturer foreligger cellene vanligvis i et p75-positiv, umodent stadium. Ved å stimulere modning av cellene med cAMP, kan vi monitorere cellenes evne til å modnes, og evaluere eventuelle forskjeller i dette mellom celler fra friske og syke hester, samt mellom friske celler tilsatt henholdsvis buffer og serum fra syke hester. For første gang siden 1995 har det i løpet av dette året ikke vært meldt inn en eneste akutt AEP hest i Norge eller Sverige. Det er selvfølgelig mulig at det kan ha vært tilfeller som ikke blir meldt inn, men vi har tidligere opplevd at det er god kunnskap om lidelsen ute i befolkningen og at det er godt kjent at vi ønsker å vite om kasus. Ettersom vi ikke har prøver fra akutte AEP affiserte hester, har vi heller ikke tilgang til tydelige inklusjoner. Det er fortsatt et mål å få tatt ut slike prøver, men i mellomtiden har vi god tilgang til nervevev med tydelige kroniske forandringer forenlig med gjennomgått AEP. Materialet fra hesten som ble avlivet nå i september er spesielt verdifullt ettersom den er en av få som har hatt sykdommen to ganger, og vi har både serumprøver fra begge tilfellene og prøver fra grovfôret. Ad C og D. Covid-19 nedstengingen hadde fortsatt store konsekvenser for prosjektet helt frem til høsten 2021. Flyttingen og ferdigstillelse av lokalene til patologen på Ås ble sterkt forsinket, og det var ikke mulig å bruke cellelaboratoriet før nå i høst. De planlagte forsøkene har derfor måttet vente, men vi forventer nå ikke flere forsinkelser videre fremover.

-

Acquired equine polyneuropathy (AEP) er en dramatisk nervesykdom som rammer nordiske hester. Det er påvist karakteristiske histopatologiske forandringer i de perifere nervene på hester avlivet pga sykdommen. Disse inkluderer re- og demyelinisering, samt hypertrofi av perikaria og proteinlignende inklusjoner i de myelinproduserende Schwanske cellene. Hypotesen er at en ukjent faktor, muligens fra fôret, påvirker metabolismen i de Schwanske cellene og fremkaller forandringene. Det er nødvendig med videre studier for å kunne belyse årsaksforholdene, men begrenset tilgang på prøver har vanskeliggjort dette. Prøvene må tas ut i umiddelbar tilknytning til avlivning og mange AEP affiserte hester kan ikke transporteres til patologi-enheter. Prøver som tas ut er dermed svært verdifulle. Ved å dyrke Schwanske celler i kulturer vil dette problemet omgås fordi man kan fryse og tine dem opp igjen til videre undersøkelser. Metoden er alt etablert på NMBU for hund og vil benyttes i studien på hest.