Innovative enzyme technology for sustainable biofuels

Konverteringen av lignocellulose holdig (ikke-spiselig) biomasse til andre generasjons biodrivstoff er et viktig element i overgangen til en mer bærekraftig fremtid. Enzymatisk nedbryting av cellulose til fermenterbart sukker er et nøkkeltrinn og er fortsatt en stor prosesskostnad, spesielt for nordisk tre biomasse (gran), siden teknologiutviklingen har vært fokusert på andre råvarer, som for eksempel maisstrå. Dette prosjektet har vært fokusert på å utnytte potensialet til en relativt nylig oppdaget klasse enzymer kalt "lytiske polysakkaridmonooksygenaser" (LPMOs). Disse enzymene har et høyt potensial for å utvikle bedre enzymatiske prosesser, men ved starten av dette prosjektet forble mange aspekter ved disse svært kraftige nye enzymene uklare, også når det kommer til deres industrielle anvendelse. I dette prosjektet har vi utviklet enzymatiske teknologier som muliggjør en kommersielt gjennomførbar konvertering av nordisk biomasse, først og fremst gran, til sukker og deretter biodrivstoff. Vi har jobbet med råstoff som var forbehandlet med ulike metoder, inkludert proprietære metoder fra to industrielle partnere, Borregaard og St1 Biofuels. Vi har forsøkt å avdekke hvordan LPMO-er fungerer under ulike prosessforhold, og har undersøkt hvordan deres effektivitet og deres interaksjoner med de andre involverte enzymene kan optimaliseres. Dette har inkludert forsøk på å utvikle nye LPMO-varianter med nye (forbedrede) egenskaper ved bruk av high-throughput mutantscreening. Virkningen av små fraksjoner av hemicellulose som er igjen i forbehandlet materiale og de mulige rollene til LPMO-er for å fjerne disse har fått spesiell oppmerksomhet. For å øke industriell relevans, har vi utforsket vi enzymatisk nedbryting av cellulose i en større kontekst, hvor vi ikke bare så på de resulterende sukkerstrømmene, men også på den resulterende ligninfraksjonen ("hydrolyselignin"). Vi har evaluert ligninkvalitet og muligheter for ligninbasert verdiskaping. Dette har inkludert lab-skala termokjemisk konvertering av lignin til bio-oljer og validering av potensialet for å oppgradere disse bio-oljene til transportdrivstoff. Høydepunkter fra andre halvdel av prosjektet inkluderer: (1) Vi har oppdaget LPMO-er som er i stand til å fjerne "recalcitrant hemicellulose", og vi har oppdaget hvordan disse LPMO-ene fungerer sammen med andre enzymer som virker på hemicelluloser. Denne nye kunnskapen blir testet i flere mulige anvendelser og kan gi nye muligheter for andre typer valorisering av cellulose, spesielt produksjon av cellulosebaserte polymere materialer. (2) Vi har publisert vårt arbeid med utvikling av nye enzymblandinger for biomassebehandling ved høyere temperaturer; resultatene viser at visse enzymcocktailer med høyere termostabilitet kan være industrielt konkurransedyktige for visse substrater, som for eksempel sulfit-behandlet gran. (3) Vi har ferdigstilt (og publisert) en integrert prosess som gir bedre solubilisering av cellulose (-> sukker) og bedre "restlignin". Restligninet er det som blir igjen etter at polysakkaridene, som cellulose, har blitt gjort løselige ved nedbrytning med enzymer (cellulaser og LPMO). Det resterende ligninet er karakterisert og videreforedlet av SINTEF. Ved å bruke av denne nye tilnærmingen, nådde vi enestående effektivitet i enzymatisk nedbryting av grancellulose. (4) Vi har vist hvordan lys kan brukes til å manipulere LPMO-aktivitet og dermed effektiviteten av cellulosenedbryting. Dette arbeidet, publisert i Nature Communications, er spesielt viktig, fordi disse lyseffektene involverer ligninet som finnes i biomassen. (5) I sluttfasen av prosjektet har vi gjort forsøk på å endre substratspesifisiteten til LPMOer for å øke vår forståelse av dette aspektet og for potensielt å skape bedre enzymer. Resultatene av dette arbeidet, inkludert high-throughput mutant screening, vil ikke bli kjent før høsten 2023. (6) Sammen med FMEen Bio4Fuels har vi utført prosessmodellering for noen av de prosessene som vi har studert i prosjektet. Doktorgradsstudenten på prosjektet forsvarte sin avhandling 24. juni 2022.

NMBUs ledende fagmiljø i feltet har behold og videreutviklet sin posisjon. Miljøet er respektert verden over og har blant annet produsert både originalpublikasjoner i toppjournaler og ledende oversiktsartikler, som siteres mye, noe som bidrar til å sette NMBU, og dermed Norge på kartet. NMBU er en ettertraktet samarbeidspartner for internasjonal akademia og industri. Likeså har SINTEFs lignin og prosesskompetanse blitt styrket; på grunn av blant annet dette er SINTEF en ettertraktet partner i f eks EU-prosjekter. Prosjektet har også bidratt til å styrke SINTEFs kompetanse innen «high-throughput screening»; denne kompetansen er svært sentral for SINTEFs rolle i flere najsonale og internasjonale forskningsprosjekter. Det er viktig å påpeke at prosjektet har vært helt avgjørende for den delen av FMEen Bio4Fuels som omhandler biologisk (enzymatisk) prosessering av biomasse. Prosjektet har ført til eller muliggjort flere typer (delvis ad hoc) internasjonalt samarbeid, som bidrar til (1) å få flere, bedre og mer relevante resultater, (2) å styrke forskningspartnernes og Norges renomme i feltet, og (3) å styrke grunnlaget for framtidig samarbeid. Prosjektet har gjort at forskningspartnere har mer kompetanse å tilby industrien. Det har vært konkret samarbeid med Borregaard (No) og St1 (Fi) med mål om å implementere nyervervet kunnskap i industrielle prosesser. Videre har prosjektet vært med på å danne grunnlaget for SFI Industriell Bioteknologi (2020-2028), hvor mange norske industrier er med. Resultater fra prosjektet har gitt grunnlag for utvikling av et helt nytt anvendelsesområde for enzymteknologi, nemlig bruk av enzymer i produksjon av cellulose-baserte avanserte materialer. Dette er et viktig område hvor det forventes mer aktivitet i tiden framover. Alt i alt har dette prosjektet styrket Norges kompetanse og internasjonal anseelse innen prosessering av ikke-spiselig biomasse og styrket norsk kompetanse innen industriell bioteknologi. Denne kompetansen er svært viktig for et samfunn på jakt etter økt bærekraft.

The biochemical conversion of lignocellulosic biomass to biofuels holds considerable promise. Indeed, the first commercial so-called second generation biofuel plants are in operation. The enzymatic saccharification step remains a major process cost, in particular for Nordic woody biomass, since technology development has been focused on other raw materials, such as corn stover. Recent research indicates that considerable improvements in enzyme technology are feasible, by adjusting the enzymes itself and by optimizing process conditions. In particular, much work remains to be done to optimize the impact of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), which are newly discovered redox enzymes that are a crucial component of today's commercial cellulase cocktails. In this project, we will develop enabling enzymatic technologies for the conversion of Nordic woody biomass (primarily softwood) to biofuels. We will work on feedstocks pretreated by in-house developed steam explosion methods and on feedstocks delivered by two industrial partners using proprietary technologies. We will study LPMO functionality under various process conditions, and investigate how enzyme efficiency can be optimized. Furthermore, we will study how blends of cellulases and hemicellulases can be tailored for our feedstocks. The impact of "recalcitrant" hemicellulose, i.e. small fractions of hemicellulose remaining in pretreated material, will receive particular attention. Simultaneous optimization of enzyme blends and process conditions should then lead to more efficient saccharification processes and, eventually, cheaper biofuels. To secure industrial relevance, we will evaluate the quality of the products (sugars and "hydrolysis lignin"). In particular, we will assess lignin quality and evaluate options for lignin-based creation of additional value. This will include lab-scale thermochemical conversion to bio-oils and validation of the potential to upgrade these to transport fuels.